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1、一种新的乙肝诊断血清免疫学指标 乙肝病毒大蛋白,乙型肝炎流行现状,乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题。 全球60亿人口中，约1/2人口生活在HBV高流行区， 约20亿人证明有HBV感染，34亿人为HBV慢性感染，其中25%40% 最终将死于肝硬化和肝癌。 全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡约75万例,中国乙型肝炎流行现状,(一) HBeAg阴性活动期肝炎增多 (二) HBV变异株增加HBV的突变率较高，,HBeAg阴性活动期肝炎,临床特点： (1) 转为肝硬化和肝癌比例较大； (2) 与年龄相关：患者年龄较大； (3) 疾病自发或持续减轻极少发生； (4) 何时停药难以确定； (
2、5) 治疗后复发率高。,HBeAg阴性活动期肝炎,HBeAg阴性乙肝与HBeAg阳性乙肝不同点： (1)慢性肝炎病情不减轻； (2)生化学和病毒学标志反复升高； (3) 可3040年无症状； (4) 约45岁左右发生肝硬化； (5) 10年后约25%发生并发症。,HBeAg阴性活动期肝炎,HBeAg 阴性的慢性乙肝流行率升高原因： (1) 持续免疫压力导致突变株选择； (2)长期治疗导致病毒变异； (3) 前C和C启动子变异； (4) 检测方法的灵敏度提高。,HBeAg阴性活动期肝炎,HBeAg 阴性活动期肝炎临床诊断现状： (1) 传统“两对半”指标不能反映此类患者HBV复制程度； (2)
3、缺乏指导合理治疗的指标； (3) HBV DNA检测不易于各级医疗机构广泛开展； (4) 临床上急需能够反映HBV复制程度及指导治疗的指标。,抗病毒治疗效果监测,临床上用于抗病毒治疗的药物 干扰素 核苷类似物,抗病毒治疗效果监测,临床上缺乏评估抗病毒治疗效果的指标。以HBV DNA阴转作为治疗的终点不恰当，此时停药病情易反复。,乙肝病毒实验室检测的缺陷,抗病毒治疗效果评价血清学指标缺乏临床上评价抗乙肝病毒治疗效果时存在一个很大的问题，即其评价指标主要是肝功能的改善与否、血清乙肝病毒DNA水平的变化以及肝组织的病理学改变等。诚然，这些指标对临床医生判断患者病情而言非常重要和实用，也是临床医生选用
4、抗乙肝病毒药物时的依据，然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制活跃导致乙肝复发则缺乏客观而有效的指标。,乙型肝炎血清学诊断技术新突破,乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前S区酶免定量试剂盒-直接定量检测乙肝大蛋白 -不用分开检测前S1和前S2,HBV-LP诊断试剂新颖之处,采用病毒样颗粒制作针对构象结构的高活性抗体 同时检测前S1和前S2 进行定量检测，用于评估抗病毒治疗效果和预后 诊断HBeAg阴性活动期肝炎的唯一血清学指标 评估治疗效果及判定治疗终点唯一血清学指标 大蛋白完全消退意味患者预后良好,乙肝病毒包膜蛋白研究进展,1995-2004年 发现大蛋白前S区有复杂
5、构象结构 1996年 发现大蛋白具有反式激活病毒复制的作用 2002年 发现导致肝细胞病变及凋亡的主要原因是大蛋白 2004年 实验室成功构建针对构象型抗原的单克隆抗体 2005年 国内公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶联免疫定量试剂盒,Hepatitis B乙型肝炎,HBV模型,HBV包膜蛋白,HBV的表面抗原的组成,HBV病毒结构成分,HBV-LP与病毒复制密切相关,根据检测血液中大蛋白的有无，判断病毒携带者体内的HBV病毒是否在进行复制。,乙肝病毒包膜蛋白 preS特性: 暴露在病毒颗粒表面 高免疫原性 参与了病毒与细胞受体的相互作用 诱导抗感染的保护性抗体的产生,Neurath AR,
6、Kent SB, Strick N, Parker K. Delineation of contiguous determinants essential for biological functions of the pre-S sequence of the hepatitis B virus envelope protein: its antigenicity, immunogenicity and cell-receptor recognition. Ann Inst Pasteur Virol. 1988 Jan-Mar;139(1):13-38.,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究
7、,Prange R, Streeck RE. Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins. EMBO J 1995; 14: 247- 256 Lambert C.et al. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral lare envelope proteins J.General Virology 2004 85,1221-1225.,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,HBV病毒颗粒表面的P
8、reS已经被证实具有独立的结构域和天然构象 很多研究致力于表达并观测PreS的结构，但是极少成功。其原因是单独表达的PreS很容易被蛋白酶所降解。,(A)内质网（ER）膜上乙肝大蛋白的拓扑结构模型 。 (B)病毒体包膜上的乙肝大蛋白的拓扑结构模型。Volker Bruss, Xuanyong Lu1, Reiner Thomssen and Wolfram H.Gerlich.Post-translational alterations in transmembrane topology of the hepatitis B virus large envelope protein. The
9、EMBO Journal vol.13 no.10 pp.2273-2279, 1994,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,HBV L包膜蛋白（大蛋白）的结构域和穿膜拓扑结构 A. 大蛋白的构成组分，含preS1、preS2及S结构B. 大蛋白在内质网（ER）膜上的拓扑结构,Carsten Lambert, Sylvia Mann and Reinhild Prange. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral large envelope proteins. Journal of Gene
10、ral Virology (2004), 85, 12211225,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,AA99169形成一个环状结构，这一序列横跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,Volker Bruss Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106 (2004) 199209 29 September 2004,AA99169,L蛋白i-pre-S形式的功能模式图。黑点表示L蛋白pre-S结构 略去S和M蛋白分泌的病毒体表面的e-pre-S结构很可能具有结合病毒
11、受体的功能。目前的数据显示L蛋白的i-pre-S结构是一种蛋白矩阵，在病毒体的形成过程中负责与核壳体相接触，包装外膜。,VOLKER BRUSS* AND KERSTIN VIELUF. Functions of the Internal Pre-S Domain of the Large Surface Protein in Hepatitis B Virus Particle Morphogenesis. JOURNAL OF VIROLOGY, Nov. 1995, p. 66526657 Vol. 69, No. 11,肝炎病毒物种特异性的感染取决于病毒进入的水平，并由病毒L蛋白上的p
12、re-S结构决定。 Arg 103和Ser 124之间的序列在不同的HBV之间是高度保守的。 Arg 103和Ser 124之间的 pre-S序列对于HBV的形成具有重要功能。,横跨前和前之间,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,VOLKER BRUSS. A Short Linear Sequence in the Pre-S Domain of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Required for Virion Formation. JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 1997, p. 93509357 Vol.
13、 71, No. 12TAKASHI ISHIKAWA AND DON GANEM. The pre-S domain of the large viral envelope protein determines host range in avian hepatitis B viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 6259-6263, July 1995,Determination of the Minimal Distance between the Matrix and Transmembrane Domains of the
14、Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Journal of Virology, June 2005, p. 7918-7921, Vol. 79, No.120022-538X, 形成特殊的矩阵结构 跨膜区，维持它们正常结构的最短距离是个,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,Pre-S的反式激活作用,乙肝病毒大分子表面抗原 （大蛋白）是一种转录活化因子,The hepatitis B virus large surface protein (LHBs) is a transcriptional activator. Virology. 1996 No
15、v 1;225(1):235-9.,Bruns M,Miska S,Chassot S,Will H. Enhancement of hepatitis B Virus infection by noninfections subviral particles.J Virol ,1998;76 ;1462-8.,乙肝鸭模型证实由大蛋白组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制 这个研究具有临床意义,对于大蛋白阳性而DNA阴性患者容易停药反跳具有参考意义.,亚病毒颗粒上pre-S的反式激活作用,原 文： Ultrastructural Analysis of Hepatitis B Virus
16、in HepG2-Transfected Cells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesis 作 者： PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAU 作者单位： Laboratoire de Biologie Cellulaire, EP CNRS 117, Faculte de Medecine de Tours, 2 bis Boulevard Tonnelle,F-37032 Tours Cedex France. 发表刊物： HEPATOLOGY Vol. 28, No. 4, 1998,在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤维体的形态发生进行的超微结构分析,大蛋白与肝细胞病变研究,大蛋白的过量表达,管状颗粒在细胞内堆积,导致体外培养的细胞5天内死亡,
