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1、第三章：微生物基因突变,突变（mutation）是指生物的遗传物质-DNA的分子结构发生改变而产生遗传性变异。 突变：染色体畸变 （大段DNA的缺失、重复、倒位、易位等）基因突变 指基因内部细微结构的变化，它可是DNA序列中单个或几个核苷酸发生改变,野生型（wild type）：在微生物遗传学研究中，人们通常把从自然界中分离的菌株称为野生型，发生突变的相应个体或群体称为突变型。突变体（mutant）：在遗传学中，把携带有突变的生物个体或群体称为突变体。表现型（phenotype）：突变后产生的可观察或可检测的性状称为表现型。基因型（genotype）：把生物个体的基因组DNA分子的核苷酸序列称
2、为基因型。,一、基因突变的类型,基因突变可从突变发生方式、引起的表型和遗传物质改变等几个方面进行分类。,按突变体表型特征可将突变体分为以下4类： 形态突变型、生化突变型、致死突变型、条件致死突变型,第一节 基因突变的类型、符号和规律,按遗传信息的改变方式可将突变分为以下3类： 错义突变：突变造成所编码蛋白的氨基酸序列的变化 同义突变：碱基改变后编码的氨基酸与野生型的氨基酸相同 无义突变：当碱基突变后形成终止密码子，使蛋白质合成提前终止。,根据遗传物质的结构改变，分为： 碱基置换 移码 DNA片段的插入和缺失根据突变发生的方式分为：自发突变和诱发突变,普遍性 无论是低等生物，还是高等的动植物以及
3、人，都可能发生基因突变。基因突变在自然界的物种中广泛存在。 随机性 指基因突变的发生在时间上、个体、位点、所产生的表型变化等都是随机的。 独立性 在微生物群体中，基因突变是独立发生的，某一个基因的突变与另一基因突变之间是互不相关的独立事件。 稳定性 基因突变的实质是遗传物质发生改变的结果，因此突变型基因和野生型基因一样，具有相对的稳定性，是可以遗传的。,二、基因突变的规律,稀有性 突变是极为稀有的，野生型基因以极低的突变率发生突变。可逆性 突变基因又可以通过突变而成为野生型基因，这一过程称为回复突变 。 少利多害性 一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰或是死亡，但有极少数会使物种增强适应性。
4、不定向性 一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。,几种细菌抗性自发突变的频率,抗药性突变的发生与药物的存在无关。 抗药性突变以一定的突变率发生。 各种抗药性突变的发生各不相关。 抗药性突变型具有稳定性。 抗药性突变型可回复突变 抗药性突变率可通过理化因素处理而提高。 抗药性突变是DNA分子某一特定位置结构改变的结果。,以细菌抗药性突变为例进一步说明基因突变的规律,三、基因的命名规则和符号,每个基因用斜体小写的三个英文字母来表示，这三个字母取自表示该基因特性的一个或一组英文单词的前三个字母。如str 表示streptomycin链霉素抗性基因。 产生同一表型的不同基因，在三个
5、字母后用不同的大写斜体英文字母表示。如trp 代表色氨酸基因，各个不同的色氨酸基因分别用trpA、trpB 来表示。,1966年，M. Demerec提出了大肠杆菌的基因命名规则，其要点：,突变型基因的表示是在基因符号的右上角加“-”，如亮氨酸缺陷型用leu -表示。抗药性基因是在基因符号的右上角加上“r”表示抗性，加上“s”表示敏感。如str r表示链霉素抗性。 某一突变型基因的表型一般也用相应的正体三个字母表示，不过第一个字母要大写。如乳糖发酵缺陷型基因用lacZ 表示，其表型则需用LacZ-表示。 当染色体上存在缺失时用“”表示，缺失部分放在符号的括号中。如（lac-pro）表示乳糖发酵
6、基因到脯氨酸合成基因这一段染色体发生了缺失。,上述规则主要在原核生物中使用，1995年，被收录到TIG遗传命名指南中，真核生物特别是高等生物尚未遵循此规则。TIG: Trends in Genetics Genetic Nomenclature Guide,第二节 基因突变的分子基础,一、碱基置换及其对遗传信息的影响,碱基置换又可分为两种类型： 转换（transition）和颠换（transversion）,AT GCCG TA,红线双箭头为转换 绿线单箭头为颠换,无义突变,二、移码突变及其对遗传信息的影响,移码突变（frame-shift mutation）是指编码蛋白质的DNA序列中插入或
7、缺失一个碱基，使翻译的阅读框发生改变而导致多肽链的氨基酸序列的完全改变。,三、缺失和重复对遗传信息的影响,大片段的缺失或重复（超过几个碱基对）是基因突变的主要原因之一。特别是在放线菌中的自发突变，其缺失或重复范围从几个基因到几十个基因。,第三节 自发突变与环境适应,一、自发突变和诱发突变,突变可分为自发突变和诱发突变。自发突变（spontaneous mutation）是指在自然条件下出现的基因突变。,诱发突变（induced mutation）简称诱变，是指利用物理、化学和生物因素人工诱发产生的基因突变。,二、自发突变的证实,有三个著名的实验对细菌抗药性来源进行了研究： 波动实验 涂布实验
8、影印实验,波动实验（fluctuation test）,Luria和Delbruck（1943年）,涂布实验（plate spread test）,Newcombe（Nature 1949年）,在12个平板上涂对T1敏感的E.coli，5*104/皿,培养3-5小时,小菌落生长时产生抗T1突变，每个平板上5*104菌落，5000个细菌/菌落,6个平板喷入T1，培养,6个平板重新涂布后，喷入T1，培养,1个抗T1菌落,多个抗T1菌落,影印实验（replica plating test）,Lederberg（1952年）,三、自发突变的机制,自发突变是在自然条件下产生的突变。从本质上讲，突变不论是
9、自然发生的，还是诱发产生的，都是通过理化因子作用于DNA，使其结构发生变化最终改变遗传性状的过程。 引起自发突变的原因徐了与微生物所处的外界环境条件外，还与细胞内自身的化学反应、DNA分子内部的自身运动、转座因子等因素有关。,DNA分子内部运动碱基脱氨基作用：如“C”脱氨基生成“T”。互变异构效应：“T”可以酮式或烯醇式两种状态存在，酮式与“A”配对，烯醇式与“G”配对。“C”和“A”则可以氨基或亚氨基两种状态存在，“C”的亚氨基与“A”配对。,DNA的环出效应与缺失自发产生缺失的机制，可能与DNA在复制或修复中的差错有关，一条DNA链发生环状突起，当复制进行时环状突起区域不复制，这样环状突起
10、区域在子代中就发生缺失。,1,A,B,C,A,B,C,B,A,C,C,A,自身代谢产物：硫氢化合物、重氮丝氨酸、过氧化氢等环境因素：各种短波辐射、高温、低浓度诱变物质等,第四节 诱变剂和诱变机制,诱发突变（induced mutation）简称诱变，是指利用物理、化学和生物因素人工诱发产生的基因突变。能够引起基因突变的物理、生物因素称诱变因素，化学试剂称诱变剂。,诱变因素种类繁多，诱变机理也不尽相同，常用的诱变因素分为以下几类：一、碱基类似物 二、作用于DNA分子化合物 三、嵌合剂 四、各种辐射,一些化学和物理诱变因素的诱变功能,一、碱基类似物,碱基类似物：是指类似于正常的含氮碱基并且能够在D
11、NA复制过程中被整合到正在合成的核苷酸链中的化合物。,诱变处理方法（以5-Bu为例）,将新鲜斜面的细菌菌种 接种液体培养基中（前培养） 对数生长期 离心收集菌体 加入生理盐水或缓冲液 饥饿8-10小时（以消耗胞内的贮存物质） 加入5-Bu到菌悬液中（终浓度25-40ug/ml）,混匀后，取0.1-0.2ml菌悬液涂布到平板培养基上 在适宜温度下培养（即诱变处理） 培养后挑取单个菌落，进行筛选,注：如果处理真菌、放线菌孢子，则应提高5-Bu的浓度，通常为0.1-1mg/ml。加诱变剂后，需要振荡培养6-12小时，以绝大多数孢子刚刚萌发为度，涂平板处理培养。,二、DNA分子上碱基的化学修饰,这类化
12、学诱变剂有：亚硝酸（HNO2）羟胺（NH2OH）烷化剂常见的烷化剂包括：甲基磺酸乙酯（EMS）硫酸二乙酯（DES）N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）氮芥等。,（一）亚硝酸的诱变机制,亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起转换而发生变异。,腺嘌呤（A）脱氨基变为次黄嘌呤（H）,亚硝酸引起碱基脱氨基作用，由A变成H时，第一次DNA复制后，次黄嘌呤不与胸腺嘧啶配对，而与胞嘧啶配对，第二次复制后A:T转换为G:C。,脱氨基的结果： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H） 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U） 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）由C变成U时，
13、第一次DNA复制尿嘧啶不与鸟嘌呤而与腺嘌呤互配，第二次复制后G:C转换为A:T； 当G变成X时，与以上两种情况不同，黄嘌呤仍然和胞嘧啶配对。,1试剂的配制 （1）1mol/L pH4.5醋酸缓冲液 称取醋酸6.12g，加蒸馏水定容100ml。称取醋酸钠8.2g，加蒸馏水定容100ml。将醋酸钠溶液缓缓加入到醋酸溶液中，搅拌均匀，调节pH至4.5，两者之比大约为1:1。（2）0.1mol/L亚硝酸钠溶液 称取亚硝酸钠0.69g，加蒸馏水定容100ml。（3）0.07mol/L pH8.6磷酸氢二钠溶液 称取磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O）1.246g，加蒸馏水定容100ml。 以上试剂使用前
14、均要灭菌。,2处理方法（以处理浓度0.025mol/L为例）取1ml孢子悬液2ml pH4.5醋酸缓冲液 1ml 0.1mol亚硝酸钠溶液 (处理浓度为0.025mol/L)于2526保温1020min加入20ml 0.07mol、pH8.6的磷酸氢二钠溶液， 使pH下降至6.8左右，以终止反应稀释分离于平板,如果处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol：将斜面新鲜菌体移人肉汤培养基 适温培养到对数期 将培养液进行离心，弃去上清液, 用生理盐水洗涤pH4.5醋酸缓冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1：1加入沉淀的菌体中，使之悬浮。于3537处理510min加入5倍的pH8.6的磷酸氢二钠溶液，使
15、pH下降到6.8。 取一定量进行后培养1.52h。稀释分离于平板上 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。,（二）羟胺的诱变机制,羟胺是具有特异诱变效应的诱变剂，专一地诱发G:CA:T的转换。对噬菌体、离体DNA专一性更强。DNA分子上和羟胺发生反应的碱基主要是羟化胞嘧啶上的氨基。,羟胺与亲电试剂，如烷基化试剂反应生成N或O取代产物： R-X + NH2OH R-ONH2 + HX R-X + NH2OH R-NHOH + HX,当羟胺浓度为0.11.0mol/L，pH6.0时，它专一地与胞嘧啶起反应，而羟化后的胞嘧啶与腺嘌呤配对，引起G:CA:T转换,当羟胺浓度为0.
16、11.0molL，pH9.0时，主要与尿嘧啶反应； 在低浓度，如10-3molL，pH9.0时，羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。 但据分析，羟胺与T、G反应的是它的产物，而不是它本身。此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氢，也具有诱变作用。,根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使A:TG:C转换，进行逆向突变。因此，可以用来鉴别突变体是 A:TG:C还是G:CA:T转换。这种鉴别常用于碱基类似物和亚硝酸等诱变剂诱发回复突变体的碱基转换。,羟胺的处理方法：常用浓度为0.1%5%，可直接在溶液中处理，时间12h，然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。,作用： 1.脱嘌呤DNA链的断裂或少数核苷酸的缺失致死效应 2.碱基的烷化错误配对点突变烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系很大。,
