《基因功能研究的新技术课件_1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因功能研究的新技术课件_1（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、,RNAi：基因功能研究的新技术,RNAi：基因功能研究的新技术,RNAi的定义 RNAi的发现和研究历程 RNAi的作用机制和特征 RNAi的生物学功能和意义 RNAi的应用 展望与思考,RNAi的定义,RNAi (RNA interference) Sequence-specific, post-transcriptional gene silencing mediated (PTGS) by double-stranded RNA RNA干涉 是指双链RNA引起的序列特异性的转录后基因沉默,RNAi 广泛存在于从真菌到植物，从无脊椎动物到哺乳动物的多种生物体中，是一种自然存在的生物学现象
2、。 目前，RNAi 已发展成为一种新的分子生物学实验技术，用于特异性地降低或关闭某些基因的表达。,RNAi的发现和研究历程,(Jorgensen R, 1990),1995年，Guo等在试图阻断线虫（C. elegans）中的par-1基因时，惊讶地发现给线虫注射正义RNA（sense RNA）同反义RNA一样，能特异性地抑制线虫par-1基因的表达，而未出现预期的正义RNA使基因表达增强的现象。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反，他们一直没能给这个意想不到的结果作出合理解释。,经过纯化的dsRNA却能够高效特异地阻断相应基因的表达，他们将这一现象称为RNA interference。,
3、Fire A, et al.,随后，dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物中。这说明RNAi机制很可能是在进化的早期阶段就已经产生了。,1999年，Hamilton 等在基因诱导的PTGS植株和病毒诱导的PTGS植株中，首次发现了长度为25nt 的RNA中间产物。2000年，Zamore 和 Hammond 等在研究中发现，RNAi实验中加入的dsRNA被首先降解成21-23nt的小片段RNA（small interfering RNA，siRNA），随后在siRNA的引导下，由核酸内切酶将同源mRNA降解。这一发现首次显示了dsR
4、NA介导的基因沉默是一个同源依赖的两步降解反应。,2000年，Wianny 和 Svoboda 等分别发现，在小鼠的早期胚胎和卵母细胞中dsRNA也能产生特异性的RNAi 效应。表明dsRNA在哺乳动物中也能诱导产生特异性的基因沉默，这为利用RNAi研究人类基因功能和基因治疗提供了崭新希望。然而，对哺乳动物细胞而言，较长dsRNA诱导的RNAi作用不象它在其它真核生物中那样高效特异。因为较长的dsRNA（长度大于30nt）的导入可能与病毒侵入细胞相似，在哺乳动物细胞中可诱发细胞内 I 型干扰素（IFN-，IFN-），导致非特异性地降解mRNA，致使基因表达减少甚至细胞凋亡。,令人振奋的是，在2
5、001年 Elbashir SM 等克服了这一障碍，找到了一种在哺乳动物细胞中关闭特定基因的新方法，他们用合成的21nt 的siRNA (small interfering RNA)，成功地抑制了不同哺乳动物细胞（人胚肾293细胞、HeLa细胞）中的靶基因的表达，同时避免了对其他蛋白质合成的抑制。从此RNAi 研究得以迅猛发展。,用 RNAi 作关键词，在 PubMed 网上可以检索到 600 多篇文章Cell 14篇 Nature 10篇 Science 13篇,BREAKTHROUGH OF THE YEAR : Small RNAs Make Big Splash #1 The Winn
6、er,RNAi as tool - companies,RNAi的作用机制和特征,Science 2002 296:1263,RNAi的作用特征,RNAi 具有高度的特异性。dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源的的mRNA降解，而无关基因不受影响。 RNAi 具有高效性。相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能产生强烈的RNAi效应，产生类似基因“剔除”的效果。 RNAi 存在放大效应。通过线虫、果蝇和小鼠的实验研究发现，少量的dsRNA 能够使大量的靶基因沉默，即便细胞增殖50-100倍仍可保持RNAi 效应，这表明RNAi 存在扩增机制。 RNAi 作用广泛并可
7、遗传。dsRNA介导RNAi不仅在导入部位产生抑制效应，而且可以跨越细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持。在线虫，果蝇等RNAi 效应可以在生物体内传播，并可传给子代。,通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP) 合成dsRNA。己知的植物病毒基因组90以上都是ssRNA，需要依靠病毒自身的 RdRP 进行复制。此外，异常的ssRNA（“aberrant“ ssRNA）也可经RdRP合成dsRNA。 转座元件产生dsRNA。转座元件（TE）是基因组中基因座位可以移动的DNA序列。TE有2类：I 型TE是返转座元件，其通过RNA的逆转录进行扩增。I 型TE是植物TE中最主要的类型。II 型TE所有
8、生物都有，以原核生物居多。 人工合成dsRNA。体外人工合成的一对序列互补的单链RNA（ssRNA），导入体内后在体内退火形成dsRNA形式，也可以在体外退火形成dsRNA形式，再导入体内。 构建表达dsRNA的质粒，转入细胞表达dsRNA。这为各类哺乳动物细胞基因功能的研究提供了强有力的工具。,dsRNA 的生成,RNAi的生物学功能,RNAi的本质是一种由RNA介导的序列特异性的获得性免疫反应，是一种原始的基因组对抗外来基因表达的保护机制，是生物体在基因组水平上的免疫系统。,1. 抗病毒感染免疫 90以上的植物病毒基因组为ssRNA，当侵入植物细胞时可形成dsRNA中间体。没有dsRNA的
9、正常植物正是利用病毒自身产生的dsRNA而诱导RNAi 效应，选择性地降解外源性的病毒RNA，达到抵制病毒的入侵的目的。2. 维持基因组中转座子的稳定性 当转座子中某些基因改变、复制时可产生hairpin dsRNA，启动PTGS反应，引起编码转座酶的mRNA降解，阻止转座酶蛋白的产生和转座子的移动，从而得以保持遗传稳定，防止遗传损害。,3. 清除异常RNA RNAi的另一个生物学功能是清除来自细胞核及细胞质的异常的无功能RNA（aberrant nonfunctional RNAs），从而发挥监视mRNA的功能。这是RNAi在基因组水平上发挥免疫监视功能的最充分的体现。4. 基因表达调控 R
10、NAi除了发挥是抗病毒感染免疫，维持转座子的稳定性以及清除异常RNA作用外，还参与蛋白编码基因的表达调控。,RNAi的应用,Loss-of-function 基因突变 RNAi 反义核酸，ribozyme 细胞内抗体 基因剔除，等 Gain-of-function 基因转染 转基因动物，等,基因功能研究的常用手段,研究基因功能的强有力工具随着人类基因组序列的完全破译，人类已进入后基因组时代。在人类基因组的30亿个碱基对当中，蛋白编码基因只有3-4万个，但约半数的基因功能未知。弄清这些基因的功能及其相互作用关系已迫在眉睫，建立一种高效、快捷、简便的确定基因功能的新技术是各国学者梦寐以求的愿望。由
11、于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变。目前，RNAi技术已逐步成为研究功能基因组学的强有力工具。,己有若干实验室运用RNAi技术对模式生物进行大规模的基因组筛选。他们主要是针对胚胎发育、细胞分裂、性腺发育这些生物学过程，筛选影响和参与其中的关键性基因。用RNAi技术进行功能基因组的筛选，其基本原理是根据基因测序结果，针对每个基因设计对应序列的dsRNA，构建成基因组的dsRNA文库，将文库中不同序列的dsRNA分别导入不同个体的细胞内，通过表型上的改变筛选相关基因并由此大致确定基因功能。这项技术将序列和功能直接连接起来，开辟了功能基因组研究的新篇章
12、。目前，利用RNAi技术对线虫约19000个预测基因的功能研究正已在进行之中。,与此同时，哺乳动物中非特异性RNAi效应的克服和新型表达载体的问世，将RNAi技术用于哺乳动物的基因功能的研究推上了应用的前沿。当前，利用RNAi技术来研究哺乳动物基因功能正如火如荼地进行着，有越来越多的研究团体正加入到这一研究队伍中来。利用RNAi技术，人们已在多种哺乳动物细胞（CHO、HeLa、293、293T、T细胞等）中成功地降低了靶基因的表达，这些被降低了的基因范围广泛，既有结构蛋白编码基因，也有催化蛋白编码基因，而靶基因降低的幅度则高达85-99%。随着RNAi技术的发展及日臻完善，RNAi技术必将成为
13、人类功能基因组学研究的革命性工具。,2. 研究信号传导途径的新方法Clemens等42应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导途径。他们首先用针对DSH3PX1和DACK的dsRNA对果蝇细胞系进行转染，Western blot分析表明相应基因的蛋白均减少了9599，表明RNAi能特异性阻断培养细胞靶蛋白的产生。然后他们利用RNAi技术分析了已知的胰岛素信号转导途径，结果发现应用RNAi技术所阐明的转导途径与已知的胰岛素转导途径完全一致。在此基础上他们又利用RNAi技术分析了DSH3PX1与DACK之间的关系，证明DACK是DSH3PX1磷酸化的上游激酶，DSH3PX1是其作用靶位。在整
14、个试验过程中他们发现RNAi技术比传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白非特异性聚集和转染效率不高的缺点。,最近，Muda等43利用RNAi技术鉴定了唐氏综合症粘附分子（Down-Syndrome cell-adhesion molecule，DSCAM）磷酸化的上游蛋白酪氨酸激酶，DSCAM是一种属于免疫球蛋白-纤连蛋白超家族的细胞表面分子，对果蝇的轴突寻径（axonal path-finding）功能十分重要，DSCAM酪氨酸磷酸化可将接头蛋白DOCK的SH2结构域传递给受体。进一步的研究发现体内的DOCK是以酪氨酸磷酸化形式存在，而DPTP61F则是使DOCK去磷酸
15、化的蛋白酪氨酸磷酸酶。Heinonen等44用RNAi技术证实了过敏反应中BTK（Brutons tyrosine kinase）对有效分泌组织胺的直接作用。实验中，他们将针对BTK的siRNA导入细胞，影象及蛋白印迹分析表明细胞中BTK的表达降低，同时，肥大细胞中促炎性介质组织胺的释放减少了20-25%。这些结果与用BTK抑制剂LFM-A13所得到的结果非常相似。这些研究显示了RNAi技术可以作为研究细胞信号转导途径的重要方法。,3. 基因治疗（病毒感染、肿瘤）的新策略如前所述，siRNA的应用有效地保证了哺乳动物细胞中RNAi效应的特异性，再同已有的高效的基因传递系统相结合，一种真正基于的
16、RNAi技术的基因治疗方法就诞生了。Hannon等用复制缺陷的逆转录病毒成功地将siRNA导入到靶细胞中，并预言了体内外的若干应用。,同时，在siRNA介导HIV的基因沉默实验中也得到了类似的结果，针对HIV-1基因组LTR和5个病毒编码基因的siRNA，可将HIV-1病毒的复制降低30-50倍。Jacque等发现针对HIV-1基因组 LTR、Vif 和 Nef 的siRNA均能抑制病毒的复制。Novina 等用针对HIV-1基因组结构蛋白Gag、调节蛋白Nef的siRNA，有效地抑制了HIV-1的感染，而针对HIV-1感染必需受体CD4的siRNA则降低了病毒侵入Magi-CCR5细胞的能力
17、。 利用针对HIV RNA或其感染必需的受体CCR5的siRNA，可以将病人的骨髓干细胞改造成对HIV感染具有抵抗力的细胞。以上研究表明，siRNA能抑制不同感染阶段的病毒复制，而感染的阻止既可用针对病毒基因的siRNA，也可以用针对参与病毒生活周期的宿主细胞基因的siRNA。,RNAi 在病毒基因治疗的研究方面也格外瞩目。目前己有多个实验室用RNAi技术对HIV、脊髓灰质炎病毒等的感染进行了研究，取得了令人激动的成果。他们用针对病毒基因组编码基因mRNA的siRNA成功地阻止了靶基因的表达，为病毒的基因治疗提供了全新的重要策略。Gitlin等用针对脊髓灰质炎病毒基因组的siRNA处理人HeLa细胞，结果发现siRNA显著降低了病毒的滴度并促进感染细胞中病毒的清除，证实了siRNA能特异性地抑制胞内RNA病毒的快速复制。,
