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1、免疫学检测技术,特异性 比例性 可逆性 阶段性,抗原抗体反应的特点,电解质 生理盐水或缓冲液，Ca2+，Mg2+ 酸碱度 pH68，补体pH7.37.4 温度 1540，37最适 冷凝集素4最适,抗原抗体反应的影响因素,检测 抗原和抗体的体外实验,颗粒性抗原或吸附于载体颗粒上的可溶性抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，在电解质参与下，出现肉眼可见的凝集现象。,一、凝集反应,颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的参与下，出现肉眼可见的凝集现象。 常用颗粒性抗原：红细胞、细菌等 玻片法和试管法,1.直接凝集反应,玻片凝集试验,结果判断,阳性,阴性,试管凝集试验,将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体
2、表面，与相应的抗体或抗原结合，在电解质的参与下，出现肉眼可见的凝集现象。,2.间接凝集反应,用已知抗原致敏载体 - 检测未知抗体,正向间接凝集试验,用已知抗体致敏载体 - 检测未知抗原,反向间接凝集试验,二、沉淀反应,沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀现象。,沉淀反应的类型,液相内沉淀反应 环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定 凝胶内沉淀反应 单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术,（一）免疫浊度测定的原理,可溶性抗原与相应抗体在特殊缓冲液中能快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体变浑浊，呈现一定的浊度。 当抗体量恒定且过量时，浊度与抗原的量成正比。
3、 利用光学测量仪器对浊度进行测定，从标准曲线查出抗原含量。,透射比浊法和散射比浊法光路,检测器A,检测器B,IC,I0,I,I,透射比浊法,散射比浊法,可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的凝胶中向四周扩散，形成浓度梯度，两者相遇并在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀物。,（二）凝胶内沉淀试验,原理： 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测抗原在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。,1.单向琼脂扩散试验,（沉淀环直径)2,抗原浓度,1.抗体混于凝胶中 2.抗原加入孔内 3.抗原自由扩散,标准品抗原浓度测定,原理： 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝
4、胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。,2.双向琼脂扩散试验,原理示意图,Ab,Ag,模拟图,染色标本图,1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧,1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。,2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。,抗体效价测定,“1” 为单一抗原抗体系统。,“n” 为多个抗原抗体系统。,*可以用混合抗原鉴定抗体纯度。,抗原抗体纯度鉴定,*可以用混合抗体鉴定抗原纯度。,免疫技术 以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。高特异性 标记技术 将可被探测的示踪物质（酶、荧光素、放射性核素、胶体金、化学发光物质
5、等）用化学方法与化合物连接。高敏感性,三、免疫标记技术基本概念,常用免疫标记技术,放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 胶体金免疫技术 化学发光免疫技术 生物素-亲和素免疫技术,基本原理： 酶免疫技术是利用酶标记抗体(抗原) 与相应抗原(抗体)反应形成抗原-抗体-酶复合物，酶催化相应的底物显色，根据颜色变化和显色深浅进行定性和定量。,（一）酶免疫技术,辣根过氧化物酶（HRP）,ELISA中应用最为广泛的标记酶 HRP常用底物 四甲基联苯胺 TMB 无色蓝色黄色,微量反应板,双抗体夹心法检测抗原,间接法检测抗体,（二）荧光免疫技术,荧光物质：荧光物质是一类经激发能发射荧光的物质。荧光色素： 能
6、产生明显荧光并可用作染料的有机化合物,常用荧光色素,荧光色素：FITC、RB200、PE等,FITC,RB200,1、直接法,荧光抗体技术类型,2、间接法,阳性细胞显色有胞质型、胞核型、膜表面型， 显色深浅可作为抗原定性、定位和定量依据。 “-”为无或仅见极微弱荧光； “+”为荧光较弱但清楚可见； “2+”为荧光明亮； “3+”为耀眼的强荧光。 “2+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“”。,结果判定,自身抗体检测,抗核抗体(均质型),抗核抗体(核膜型),抗核抗体(斑点型),荧光抗体技术的应用,（三）放射免疫技术,电化学发光免疫分析（ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以
7、三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。,（四）电化学发光免疫技术,电化学发光免疫测定示意图,46,（五）胶体金免疫技术,金免疫技术（免疫金标记技术、免疫胶体金技术）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金原子颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。,胶体金结合物,固相NC膜,DICA 试剂条,样 品 垫,结 合 物 垫,NC 膜,吸 水 垫,DICA双抗体夹心法测抗原,样 品 垫,结 合 物 垫,NC 膜,吸 水 垫
8、,试验方法,免疫层析试验以双抗体夹心法为例。,免疫印迹试验,（六）免疫印迹技术Westernblot,免疫细胞功能的检测,PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 常用分层液：ficollhypaque，percoll,一、免疫细胞的分离和纯化,聚蔗糖-泛影葡胺分层液(ficoll)法是一种单次密度梯度离心分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。原理： Ficoll分层液：密度1.0770.001 将肝素抗凝全血加在分层液上，水平离心,聚蔗糖-泛影葡胺分离法,Ficoll分层液分离单个核细胞示意图,方法类型： 1.E花环沉降法T细胞-绵羊红细胞受体(CD2),二、淋巴细胞亚群的分离,E花环沉降法,2.荧光激活细胞分选仪分离法,液流系统示意图,光学系统示意图,光学系统,压电晶体,产生机械振动,不充电,充电,分选基本原理,三、免疫细胞功能测定,T淋巴细胞功能检测T淋巴细胞转化（增殖）试验,T淋巴细胞,DNA合成,分化,淋巴母细胞,刺激物PHA、ConA,细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松,T淋巴细胞增殖试验,形态学检查法,
