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1、酶联免疫吸附双抗体夹心法 测定血清中甲胎蛋白含量,临床八年1205班2组 陈旭 陈楷 李皓,一、实验目的,1 掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理,2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法,二、实验原理,基础知识 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenz
2、ymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。,甲胎蛋白（ fetoprotein，AFP） 一种含4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD，半衰期 5天，由592 个氨基酸残基的单肽链组成。基因位于第4对染色体4q1124q21区域，由 15 个外显子和14个内含子组成，属于血清中一种球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。它对原发性肝癌的早期诊断具有重要意义，同时对肝细胞癌的鉴别诊断，流行病学调查和理论研究都很有价值。,原理一 ELISA的基础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的酶标记。结合在固
3、相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。 原理二 抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。 原理三 固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。,ELISA的三条基本原理,双抗体夹心法,方法 用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色。 固相(包被)抗体Ab + 样品(抗原Ag) + 酶标抗体Ab * Ab-Ag-Ab* + 底
4、物(TMB)显色 应用 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。,双抗体夹心法图示,三、实验仪器&试剂,仪器 全自动酶标仪、全自动酶标洗板机,试剂 待测血清、抗-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色液、终止液 OR: 甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法）,四、实验步骤,获得AFP未标定抗体,将AFP抗体与固相 载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的 抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加
5、血清形成 固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他 未结合的物质,加HRP酶标抗体生成 抗体待测抗原酶标记抗体 的复合物,彻底洗涤未结合 的HRP酶标抗体,加底物四甲基联苯胺(TMB) 进行酶催化反应,根据颜色反应的程度 进行AFP的定量测定,详细步骤,1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分
6、别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L ，1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。,2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶
7、标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置37温育30 分钟。 4. 配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。 7. 温育：操作同3。 8. 洗涤：操作同5。 9. 显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟. 10. 终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。
8、测定应在加终止 液后15 分钟以内进行。,辣根过氧化物酶(HRP),常用底物： (1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 (2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。,五、结果分析,以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方
9、程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。,六、思考题,试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？,（一）固相载体 （二）抗原 （三）试验样品 （四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂 （六）底物 （七）作用时间 (八)试验的重复性（精确度） （九）对使用仪器要求,六、应用,检查抗原半抗原 1.内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等 2.在血液学方面可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等 检查抗体 1.在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。 2.在病原微生物方面已用于检查链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体。,谢谢大家！,
