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1、彭英中国医学科学院 药物研究所 2012-6-8,抗老年性痴呆药物筛选与评价,2012年“药理学研究新技术新方法”,1,老年性痴呆的介绍 研究老年性痴呆常用的动物模型 研究抗老年性痴呆药物的主要方法,主要内容,2,又称阿尔茨海默病（Alzheimer s Disease， AD ），是老年人最常见的一 种病因不明的大脑退行性变性病，是引起痴呆最常见的病因。患者多发病于50岁前后，女性多于男性（约1.52:1）。 早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力、空间辨别能力、认知能力会逐步衰退，并会出现性格和行为的改变。
2、在65岁以上的人群中，大约10%患有该病，全世界约有2400万患者。 目前没有准确诊断和有效治疗的方法。,老年性痴呆,3,Alois Alzheimer,AD的历史,Auguste Deter,1906阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性痴呆表现的51岁女性患者。当医生给她看一个物体时，她最初能够说出这个物体的正确名称，重复几次都是一样，但是以后突然间，她把一切都忘掉了。当阅读一本书时，她可能无缘无故地跳过一些句子，她也许会一个字母、一个字母地拼读每一个字，也许会读起来完全没有抑扬顿挫。在书写测验时，她会反复书写同一个音节，而完全忽略其他的音节，因而变得完全错乱，六神无主。当她讲话时，常常是使用
3、杂乱无章的词句，应用似是而非的表达方式。 有时，在说话时会突然停下来，一言不发。不能理解向她提出的任何问题。找不到回自己住处的路。病情逐渐恶化，四年半后死亡。患者死后病理检查显示：大脑皮层萎缩，神经原纤维缠结。其后，又有类似的病例报道。因其发病于老年前期，早期认为这是一种和老年性痴呆不同的疾病，于1910年把这种病命名为阿尔茨海默病。,4,AD的分类,AD分为家族遗传性（Familial Alzheimers disease, FAD)和散发性（Sporadic Alzheimers disease, SAD） FAD分为早发型（Early onset，多发病在40-60岁）和晚发型（Late
4、 onset AD，LOAD多发病在65岁以上) APP：是第一个在早发家族性AD家系中被发现，定位于21q21.1-21.3，含19个外显子，其中第16 和17外显子编码的APP水解片段A被证实为AD患者脑中SP的主要成分。 PS1/2：PS1基因定位在14q24.3上，含467个氨基酸残基；PS2定位在1q41.2上，含448个氨基酸残基，PS1基因有100多个突变与常染色体显性遗传早发性AD有关，只有7个这样的突变在PS2基因被发现。 Tau：Tau蛋白基因位于17q21，包括16个外显子。在中枢神经系统2、3、10外显子间不同mRNA的剪接，表达6种Tau蛋白的同功异构体。 ApoE：
5、在第19对染色体上，ApoE基因的多态性与AD有着密切关系。在ApoE2,3,4等位基因中，ApoE4等位基因型是AD最主要的危险因素，主要与晚发型的散发性和晚发型家族性AD有关。,5,年龄是一个主要的危险因素,年龄 患病率65-74375-8418.7%85+ 47,年龄是AD发生的主要危险因素,6,From 2000-2007, Alzheimers Disease Deaths Increased 50.6% while ,Deaths by: HIV declined 22.0% Stroke declined 18.9% Heart Disease declined 13.3% Pr
6、ostate Cancer declined 6.4% Breast Cancer declined 3.1%,Alzheimers Disease,HIV,Stroke,Heart Disease,Prostate Cancer,Breast Cancer,AD的发病率,7,AD的临床症状及分型,8,9,The self-portrait of William Utermohlen,10,AD的脑改变,海马参与编码短期记忆，AD首先破坏了海马的神经元以及海马和大脑其他部分的连接通路。这种破坏导致了短期记忆的损伤。 当大脑皮层受累后，语言能力和判断能力就被削弱，人格也发生了改变，包括情绪的爆发
7、以及烦躁的行为。 最后全脑受累萎缩。,11,AD的脑改变,AD大脑体积和重量都会缩小，大脑皮质变得空虚而满是裂隙。,12,Neurofibrillary Tangle,Senile Plaque,AD特征性的病理改变,13,(Selkoe DJ, Physiological Reviews 2001),Amyloid Precursor Protein Processing and A generation,14,Neurofibrillary Tangles Formation,p35,p25,CDK5,Akt,GSK-3/,Calpain,15,Neurofibrillary Tangle
8、s Formation,16,A蛋白毒性学说 Tau蛋白异常与神经纤维缠结 基因突变学说 胆碱能系统异常 氧化应激 炎症反应 神经递质失调 神经元凋亡 微量元素代谢紊乱 胆固醇代谢异常,AD的发病机制,17,Current Therapies,与神经递质有关的药物胆碱能药物：胆碱酯酶抑制剂、M胆碱受体激动剂非胆碱能药物：单胺氧化酶抑制剂 2. NMDA受体拮抗剂：美金刚 抗氧化剂：VitE、CoQ10、EGb761 非甾体类抗炎药 神经营养因子：NGF、BDNF 雌激素 脑细胞代谢增强剂脑细胞代谢激活剂：脑复康、奥拉西坦脑血循环促进剂：都可喜、喜得镇钙离子拮抗剂：尼莫地平、氟桂嗪 8. 针对A
9、的治疗BACE抑制剂、分泌酶抑制剂、防止A形成寡聚体、增强A从大脑中清除、金属离子螯合剂、调整体内胆固醇平衡、 A抗体等。 以tau为靶点的治疗微管稳定剂、GSK-3抑制剂、CDK-5抑制剂、tau抗体。,18,Current Therapies,19,A-Based Therapeutics,(Barten DM & Albright CF, Mol Neurobiol 2008),20,Tau-Based Therapeutics,(Barten DM & Albright CF, Mol Neurobiol 2008),21,Current Alzheimers disease drug
10、 development programs,22,Current Therapies,23,研究老年性痴呆常用的动物模型,24,AD动物模型,一、以衰老为基础的AD动物模型 自然衰老认知障碍动物模型：动物：大鼠、小鼠和猴子方法：采用6月龄Wistar大鼠，饲养12个月，成功建立自然衰老大鼠模型。特征：学习记忆和空间辨别能力缺损、神经元凋亡、胆碱能功能受损、氧化损伤、tau蛋白异常磷酸化、BACE蛋白表达增加、线粒体功能受损(18月龄自然衰老大鼠）。,25,一、以衰老为基础的AD动物模型 2. 快速老化小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)由日本京都大学竹田俊男
11、教授经20年培育而成，具备均一的遗传背景和稳定老化病态特征。包括快速老化的P系(SAMP)和抗快速老化的R系(SAMR)两大系，SAMR1常被用作正常对照。特征：青年期出现脱毛、活动低下、白内障、角膜混浊、骨质疏松等老化现象，而且寿命明显缩短。中枢学习记忆功能呈增龄性加速衰退。线粒体功能紊乱和氧化应激损伤。脑内有大量A沉积。脑内与学习记忆功能相关的神经递质也发生改变。,AD动物模型,SAMP1 (lower) and SAMR1 (upper) males of 12-month-old,26,AD动物模型,一、以衰老为基础的AD动物模型 3. D-半乳糖（D-gal)诱导的亚急性衰老模型D-
12、半乳糖衰老动物模型是由国内学者龚国清等在1991年根据衰老的代谢紊乱学说而构建的。与其他几种衰老动物模型如SAMP系小鼠衰老模型和自然衰老模型等相比，该模型简便易行，价格低廉，结果稳定，适用于抗氧化抗衰老药物研究。 方法：正常大鼠或小鼠，腹腔注射或颈背部皮下注射D-半乳糖50500mg/kg，1次/天，连续6-8周，造成衰老模型。 特征：动物出现明显衰老体征，空间学习和记忆能力下降。机体氧化自由基产物MDA与脂褐质增加，而抗氧化酶SOD活力显著降低。神经元变性凋亡增多。视网膜色素上皮超微结构的改变。免疫方面显示IgG水平下降，T淋巴细胞转化功能下降，血清干扰素下降。,27,AD动物模型,胆碱能
13、系统的活性与人的学习记忆与认知活动过程密切相关。基底前脑胆碱能神经元、海马和皮层及它们之间的通路，是学习记忆功能的 重要结构基础。AD脑组织中发现的第一个神经递质异常是乙酰胆碱（Ach），合成和降解Ach的酶活性发生变化。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前Ach的合成、ChAT的活性以及对胆碱的摄取能力都明显下降，这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关。,二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型,28,AD动物模型,二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型 东莨菪碱诱导的AD模型作为M型胆碱能受体的拮抗剂，东莨菪碱(Scopolamine)可以通过血脑屏障进入中枢阻断脑内的M受
14、体，从而导致整个大脑的胆碱能神经传导障碍。方法简单、重复性好，可用于药物初筛。动物：大鼠、小鼠方法：大鼠在实验前30min按5mg/kg体重腹腔注射东莨菪碱。小鼠在实验前30min按1mg/kg体重腹腔注射东莨菪碱。特征：短期的学习记忆障碍。胆碱酯酶活性增高。SOD活力降低，MDA水平升高。,29,AD动物模型,二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型 2. 鹅膏氨酸诱导的AD模型（化学损伤）谷氨酸受体激动剂鹅膏草氨酸(Ibotenic acid，IBO)是一种神经兴奋毒性剂，动物脑 内注射后可致脑基底核部位神经元变性、坏死，并可导致大脑皮层和海马等部位神经元减少，引发动物行为迟钝、学习及记忆能力
15、下降等拟似痴呆症状。 另外，海仁酸(Kainic acid，KA)、使君子酸(Quisqualic acid，QA)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)等注入动物的基底大细胞核可建立AD模型。 方法：SD大鼠，雄性，体重280-300g。在立体定位仪引导下将微量注射器的针头插入颅骨下7.3mm。将1.0l的鹅膏氨酸（5g/l）在5min内缓慢注入前脑基底核，假手术组注射等体积的生理盐水，留针5min后拔出。中线对侧对称部位同法同量注射后，缝合头皮。手术后，模型组大鼠苏醒时间显著长于假手术组，造模死亡率为20%。 特征：空间学习和记忆能力下降。CHAT阳性神经元数目减少。,30,AD动物模型,
16、二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型 3. 选择性免疫毒素192-IgG-saporin诱导的AD模型（免疫损毁）192-IgG-saporin是一种抗神经免疫毒素，一侧侧脑室注射192-IgG2-saporin后，它和细胞膜上P75受体结合进入细胞浆，192-IgG和saporin分离， saporin 作用于核糖体，使核糖体大亚基失去活性，从而阻止了蛋白质的合成，导致细胞的死亡。将192-IgG-saporin注射到脑内，显示基底前脑的胆碱能神经元受到严重破坏，但该区域的其它神经元则未受损害。 方法：SD大鼠，雄性，体重280-300g。在立体定位仪引导下侧脑室注射192-IgG-saporin溶液 2.5g/5l，三周后进行行为学实验。 特征：空间学习和记忆能力下降。新皮质、海马及嗅球部位的ChAT阳性神经元数目减少，而新纹状体、中脑、脊髓等部位ChAT阳性神经元的数量没有变化。,31,AD动物模型,二、以胆碱能学说为基础的AD动物模型 电损伤、外科损毁所致AD模型通过对动物进行手术，参照动物脑立体定位图谱，用电灼伤损毁基底前脑Meynert（NBM），外科手术切断海马穹窿伞。手术后动物出现了学习和记忆功能障碍，但病理上未出现SP和NFT，且这种方法损毁范围较大，目前已基本不采用。,
