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1、2018/9/25,1,流感病毒细胞分离培养,2018/9/25,2,一、组织培养概况,（一）组织培养定义组织或细胞培养是指从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。,2018/9/25,3,（二）、组织培养的原理,组织培养主要是为病毒易感的组织细胞提供一个良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获得生长繁殖的能力。病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方面的变化，可出现细胞病变并释放病毒到维持液中，这种情况可用细胞病变、色变法及检测维持液中病毒抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。有些病毒不引起细胞病变，有些在核内繁殖不易释放到维持液中，前者可用干扰的方法及免
2、疫荧光的方法来检测病毒，后者常采用冻融破坏细胞获得病毒后检测。,2018/9/25,4,（三）、组织培养所需的材料和条件,1、组织或细胞来源：人、猴、啮齿类、禽的胚胎、脏器以及昆虫等为组织培养常见的组织来源。用于病毒培养的往往是病毒的自然宿主细胞。如人类病毒用人和猴组织较敏感，但有些病毒用其他宿主细胞亦很敏感，如乙脑病毒对白纹伊蚊细胞系C6/36较人的细胞更为敏感。流感病毒对狗肾传代细胞（Madin darby canine kidney,MDCK）亦很敏感 。,2018/9/25,5,2、单细胞的制备（略）,2018/9/25,6,3细胞培养的基本条件：（1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度
3、越快，接种传代细胞一般为1030万/ml。（2）合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640，Eagles MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水化合物、维生素、无机盐及其他成分。配制培养液的水一般用单蒸后的去离子水。合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养是不可缺少的；不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁，不同血清对细胞促进作用不同，以胎牛血清最好，每批血清使用前需以5630分钟灭活处理。含有10%血清的培养液能促进细胞增殖，称为生长液。,2018/9/25,7,（3）酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是7.07.4。培养环境偏酸较偏碱更宜于
4、细胞贴壁。PH的变化主要取决于，HCO3-浓度、二氧化碳分压，细胞糖代谢能力。使用二氧化碳培养箱，能提供稳定的5%二氧化碳。可自动调节细胞代谢引起的PH改变。（4）温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致，温度增加23对细胞产生不良影响，使之在24h内死亡。低温对细胞影响较小。,2018/9/25,8,（5）无菌条件：细胞培养的关键之一是要有无菌概念，要防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进行彻底消毒，在操作时要严格实行无菌操作。（6） 培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长
5、影响很大。常用的器皿主要有玻璃及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜、清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。塑料板一般用2%NaOH浸泡1小时后，清水洗净再用1N HCl浸泡1小时，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37干燥后，紫外线照射消毒。,2018/9/25,9,(四）组织培养的优缺点及应用范围：,优点：可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，对疫苗生产来说，其抗原性更接近于自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反应。 缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易使病毒滴度丢失，传代细胞含致癌因子，不宜用于疫苗生产。且随着细胞代数增加，对病毒敏感性也随之下降。 应用范围：目前组织培养
6、技术已应用于病毒学的各个部门，不仅应用于病毒性疾病的诊断及疫苗制备，也深入应用到病毒学基础理论的研究,2018/9/25,10,二、组织培养分离流感病毒,流感监测最主要的目的是及时发现并分离到有意义的流感病毒新变种，尤其大流行株，用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预报。组织培养技术是分离，诊断流感病毒最常用和最可靠的方法之一。 人流感病毒最初是通过雪貂分离出，但雪貂繁殖慢，量少，价钱昂贵并难饲养，故无法加以广泛应用。上世纪30年代中开始，多用鸡胚来分离流感病毒。,2018/9/25,11,近来由于PCR技术突习猛进地发展，发现了通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，而通过
7、MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。近来由于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为各流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。由于MDCK等一些传代细胞属肿瘤细胞系，用其分离的病毒不能用于疫苗制备，故要求进行流感病毒分离时，同时采用鸡胚和MDCK细胞。,2018/9/25,12,（一）MDCK细胞分离流感病毒 1、实验材料：,MDCK细胞（最好是早代的） Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰胺的以抽滤为好） Hank氏溶液 0.25%胰酶和Versene消化液 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真菌素 胎牛或小牛血清
8、 5.6%或7.5%的NaHCO3.,2018/9/25,13,（1）细胞生长液配制90ml Eagles液+含终浓度为100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml小牛血清+2ml 5.6%NaHCO3 PH调至 7.2-7.4。（2）细胞维持液配制:同生长液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为23ug/ml胰酶，用前用NaHC03将PH调至中性或偏碱。维持液的作用是使细胞停止繁殖，但仍保持代谢。,2018/9/25,14,2、MDCK细胞传代,（1）先把需用的Eagles和Versene放37水浴预温，其它试剂不得放入。 （2）已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。用Versene
9、洗2遍。 （3）把Versene与0.25%胰酶按71比例配成消化液。 （4）置37恒温箱510min，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。 （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37 23，取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液，稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3天需传一代。,2018/9/25,15,3、MDCK细胞保存及复苏,MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。（1）MDCK细胞保存：将单层细胞消化分散成为单细
10、胞，加入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亚砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，缓慢冻存：先放42h，转放704h，再转放液氮中长期保存。（2）MDCK细胞复苏：细胞冻存管从液氮罐取出后，速放37水浴溶化，1500rpm/分离心1分钟，弃上清、沉渣加入若干ml培养液，混匀后加入细胞培养瓶中，置37二氧化碳温箱培养。,2018/9/25,16,4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试,MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用早代与要测试的MDCK细胞对
11、其进行TCLD50测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或以上Log,表明其对病毒的敏感性已下降，不应再加以使用 。,2018/9/25,17,5、MDCK细胞病毒接种和收获,（1）在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞生长状态。 （2）成片的细胞弃生长液，用Hanks液洗两遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清中含有流感病毒非特异抑制素，会影响流感病毒的复制。（3）每瓶加入接种标本0.5-1.0ml，轻摇细胞瓶，置35吸附1-2h。 （4）倒掉感染液，再用Hanks液洗12遍，每瓶加入3ml维持液，置33-35培养。,2018/9/25,18,（5）次日起每天检查有无细胞病变（CPE）。CPE特征
12、为细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或碎裂，严重时细胞部分或全部脱落（见附图）。 （6）收获及红细胞凝集活性（HA）检查：当CPE出现+号时进行收获，由于CPE无法证实就是流感病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集活性（HA），出现细胞凝集的为阳性标本， 收获所有的维持液进行病毒鉴定，也可暂冻存之 。由于维持液中无牛血清，同时含一定量的胰酶和NaHCO3，故不应在4保存，否则易造成HA活性丢失和PH变高。维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中复制能力。 （7）传代及盲传：如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，把HA滴度提高或增多。,2018/9/25,19,（二）细胞培养中应注意的一些问题,1、消化时间过长（30min-1h）或胰酶保存时间太久，应改变胰酶的浓度或二次消化。2、细胞的保存问题。取到早代细胞种子时一定要及时地保存起来以防丢失或污染。3、用Eagles液之前请先查明是否已含谷氨酰胺，如不含，应补加之。4、温度的问题。温度增加2-3对细胞产生不良影响，使之在24小时之内死亡。低温对细胞影响较小。细胞一般37放7天大部分脱落。室温放10天不但脱落，形态都有一些代谢改变。在4放20天细胞能保持良好形态，如需使用时在37放置23小时即可。,2018/9/25,20,2018/9/25,21,谢 谢 大 家！,
