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1、核酸提取原理及方法,遵义医学院珠海校区生物化学与分子生物学教研室,http:/,前言,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,http:/,主要内容,核酸简介 质粒DNA提取 PCR扩增目的基因 琼脂糖凝胶电泳,http:/,核酸简介,核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5- 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。DNA主要储存遗传信息。,http:/,核酸简介,http:/,核酸简介质粒DNA,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大
2、小从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。,http:/,质粒DNA提取,质粒DNA提取的方法：碱裂解法煮沸法,http:/,质粒DNA提取碱裂解法原理,http:/,质粒DNA提取及检测实验准备,1.实验器材台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。 2.实验耗材无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。 3.实验试剂L
3、B培养基、抗生素、琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、TAE电泳缓冲液等。 4.实验材料对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5）,http:/,质粒DNA提取碱裂解法,碱裂解法试剂配方,http:/,质粒DNA提取实验流程,离心,详细实验步骤请参考说明书！,实验步骤,（一）提取质粒,(1)培养细菌:大肠杆菌接种到5mlLB培养基中,37度振荡培养8-16小时； (2)收集菌体：取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液； (3)裂解：加入200ul溶液I,充分吹打混匀后, 加入400ul溶液,温和颠倒5-10次,
4、零下20度放置5分钟.加入300ul溶液,温和颠倒5-10次,放置5分钟. 12000rpm离心5分钟； (4)收集质粒：加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀. 12000rpm离心5分钟,取上清。,(5)加入1/10体积的3mol/L醋酸钠，2倍体积无水乙醇混匀，冰浴5分钟,12000rpm离心10分钟,去掉上清液,晾干除乙醇。 (6)加入50ul 含RNA酶A（20ug/ml)的TE缓冲液，（37度水浴），溶解提取物。,实验原理 实验仪器实验试剂实验步骤,PCR扩增制备目的基因,实验原理,多聚酶链式反应的原理类似于DNA 的天然复制过程。在待扩增的DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸
5、引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增2n 倍。1 变性：加热使模板DNA 在高温下（94 ）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2 退火：使溶液温度降至5060 ，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。3 延伸：溶液反应温度升至72 ，耐热DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP ) ，按5 3方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3 个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA 量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板
6、，经过25-30 个循环后DNA 可扩增106-109 倍。典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP 、两个合成的DNA 引物、耐热Tag 聚合酶。,实验仪器,1. PCR 热循环仪 2. 移液器（0.5-25L） 3. PCR板,实验试剂,110 缓冲液500 mmol/L KCI 100 mmol/L TriS HCI ( pH 8.3 ，室温）15 mmol/L MgCl2 2. dNTP Mix2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 3. Tag 酶 5 U/L 4.
7、DNA 模板 1 ngL 5引物1 引物2 7引物溶液浓度2uM,实验步骤,1在200ul Eppendorf 管内配制50ul 反应体系：模板DNA 2.0L2PCR 缓冲液 20L 引物 2.5L 引物2 2.5LddH2O 19L Mgcl2 5LTotal 50L,2 按下述程序进行扩增94 预变性 10 min ; 94 变性 1 min ; 60 退火 1 min 72 延伸 2 min 30cycle72 延伸 8min 4 pause,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,1.原理：DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不
8、同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,2. 琼脂糖凝胶分离DNA的范围,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,3.DNA染料A:EB溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB）可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。,http:/,B：新型低毒染
9、料：如Gold View、SYBR Green、SYBR Gold等。 毒性较低，但价格较昂贵。 灵敏度较好，但不如EB。,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,4.琼脂糖胶液制备（1%，50 ml）4.1 称取0.4 g琼脂糖，置于200 ml锥形瓶中，加入40 ml 0.5TAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶解。一般需反复煮沸3次，琼脂糖才能充分溶解。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发；4.2 待胶液冷却至60左右时，加入5%的Gold View染料，混匀，既成琼脂糖胶液。,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,5.凝胶板的制备
10、5.1 将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入胶槽中，使凝胶厚度约为0.3-0.5 cm，赶走气泡后迅速插上梳子，让胶凝固。 5.2 待凝胶完全凝固后（约2030 min），小心从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，让液面高出胶面1 mm左右。,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,6.加样取待检测样本适量，按照5份上样液搭配1份 6DNA Loading Buffer的比例混匀（注意不要产生气泡），用微量移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。,http:/,DNA的琼脂糖凝胶电泳,7.电泳加完样后立即接通电源。控制电压小于8 V/cm，电流在100 mA以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶2/3时，停止电泳。 8.成像在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。保存图像。,http:/,质粒DNA提取电泳检测,琼脂糖凝胶电泳检测,
