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1、1,色谱法,色谱法是一种物理或物理化学的分离分析方法，其分离原理主要是利用物质在流动相和固定相中的分配系数、或吸附能力等的差异而得到分离。,随着临床药学的迅速发展，色谱法在体内药物分析中的应用更为广泛，具有不可取代的重要地位，已成为体内药物分离检测最重要的方法,2,液相色谱法是应用最广的分离分析方法， 特别是对于复杂样品的分析尤为重要。液相色谱法的分支很多， 广义的液相色谱法包括：高效液相色谱法、薄层色谱法、超临界流体色谱法、毛细管电泳法等类别， 而它们又各自包括多种方法。,色谱法包括纸色谱、薄层色谱、凝胶色谱、气相色谱和液相色谱,3,第一节 薄层色谱法（TLC）,是指将固定相均匀地涂布在具有
2、光洁表面的玻璃、塑料或金属膜等表面上形成薄层，将被分离物质点在薄层板的一端，置展开室中，展开剂借毛细管作用从薄层点样的一端展开到另一端，在此过程中不同物质可以进行色谱分离。,根据不同的分离机制，薄层色谱法可以分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和凝胶薄层色谱。,4,薄层色谱的特点： 可以同时平行分离多个样品；分析成本低；对样品预处理要求低；薄层板一次性使用，对样品要求不高；对固定相、展开剂的选择自由度大。,传统的TLC法缺点： 展开时间长、展开剂体积需求大和分离结果差等。其色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的饱和度、环境温、湿度等因素的影响，有时难于重复；
3、显色易受均匀性、灵敏度、稳定性等影响，这均使测定结果偏差较大。,5,是近年来迅速发展的一种高效、快速、操作简便、结果准确、灵敏度高和重现性好的薄层色谱新技术，它采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素等为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性，已广泛用于各个领域。,高效薄层色谱法 high performance thin-layer chromatography (HPTLC),与传统TLC相比，高效薄层色谱法在薄层制备、展开方式、分析鉴定手段以及相配套的仪器设备等方面进行了 许多改革，其中最根本的是固定相的改进。,6,7,而在TLC、HPTLC和U
4、PTLC三种规格的预制硅胶薄层板中，又以HPTLC最能体现出薄层色谱分析效率高且经济实用的特点。其应用在目前的科研和日常分析中越来越得到普及。无定形HPTLC硅胶的平均粒径和粒径分布范围相对TLC有较大改善，以较短的展开距离和时间就可以获得较高的理论塔板数和分离度。 由于成分斑点更为集中，因此所需的有效涂层厚度也大为减少，检测灵敏度也因而较TLC有一个数量级的提高。,8,C18：弱极性,Diol: 二醇醚改性,CN：丙基腈改性,NH2：丙氨基改性,9,10,11,12,两个基本要求： 第一，点样位置需精确； 第二，尤其对于定量分析，点样体积需要精确和准确。,点样,为了提高分离效率，原点在展开方
5、向应该尽可能小，对于HPTLC，应小于1.5mm，,点状点样：体积受到严格限制。在HPTLC板上点状点样体积通常为0.1-1L。溶剂在板上扩散会“环形色谱”。 非接触喷雾式条带状点样：均匀，可提高解析度和检测限。,由于HPTLC扩散小，10*10cm板可点16个样品,13,14,薄层色谱有别于其他色谱技术，除了都有固定相和流动相外，还存在气相。气相会对分离结果产生显著影响。展开室预先用展开剂饱和 展开距离 由于TLC中流动相的速度不是固定的，而是随展开时间和展开距离增加而降低，所以展开距离有一定限制。通常在HPTLC板上5cm展距分辨率较高,展开,15,1、显色剂显色法：喷雾显色，借助喷雾器喷
6、细雾至板面湿润。 2、紫外线照射法：如AFTB1在WL365nm观察； 3、对本身是有色的斑点则不需显色。,显色,16,1、定性：斑点显色后量出高度，求得Rf值2、定量方法 目视直接比较法洗脱测定法薄层扫描法,定性定量,17,薄层扫描法一般由薄层扫描仪完成。该仪器一般由下列部分组成计算机、光源、单色光器、监测器、打印机、记录仪。按测定方法分可分为透射法、反射法。按其扫描方式可分为线性扫描法、锯齿扫描法、飞点扫描法或称之为微光点快速扫描法。瑞士和日本岛津类型仪器所采用的是锯齿扫描或飞点扫描法。目前是以锯齿扫描和飞点扫描法为佳。,18,19,20,21,瑞士卡玛CAMAG公司的仪器,全自动、 半自
7、动、 手动点样仪条带状喷雾式样品点样,22,CAMAG全自动展开仪（ADC2）,薄层板切割器:,23,西洋参在UV366下的色谱图（指纹图谱）,Visualizer数码成像系统,24,薄层色谱扫描仪、工作站 可进行薄层色谱光密度分析,一整套仪器要30多万人民币,25,例子： 高效薄层色谱法测定人血清中盐酸胺碘酮,盐酸胺碘酮为临床上常用的抗心律失常药物，其治疗指数低安全范围窄，且个体差异大，为了解治疗效果与血药浓度的关系，我们建立高效薄层色谱法(HPTLC)。本法操作简便易行，不失为临床盐酸胺碘酮监测的有效方法。,26,供试品溶液的制备,精密量取血清1. 0 mL置磨口试管中，加入 l.0 mL
8、 pH3盐酸溶液，再加人3.0 mL的氯仿，振荡，移出氯仿层。提取两次。将两次氯仿液合并，于55水浴上蒸干，点样前用约0.1 mL 氯仿溶解。,27,薄层色谱条件,样品与标准品分别点于同一含羧甲基纤维素钠(为粘合剂)的硅胶60 GF254薄层板上，以无水乙醇一氨水(50：1)为展开剂水平展开，取出晾干，置紫外灯(254nm)下确定斑点位置。斑点颜色为黑褐色,28,采用双波长反射法锯齿扫描：测定波长242nm，参比波长370rim；背景补偿；线性参数Sx：3；扫描步距Y=004；狭缝宽度0.4mm0.4mm。薄层扫描图见图2。,薄层扫描条件,29,血清标准曲线的制备,分别精密吸取对照品溶液(浓度为1.0gmL)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0L加人磨口试管中，再加人血清l.0mL，按供试品溶液的制备方法操作,30,取同一对照品溶液，分别点于5块含羧甲基纤维素(为粘台剂)的硅胶60GF 薄层板上(4种不同点样量)依法展开后扫描测定。吸收数据见表3。,板间误差测定：,稳定性试验、板内误差测定、仪器精密度测定、回收率试验 都很好,31,样品预处理：TLC法直接取离心后血清,测定TLC法：用微量注射器分别取乐果标准溶液和血清样品各2L ，点在薄层板上，展开剂 1：1(vv)正己烷：丙酮,1-5，10、50、100、200、500 g/ml乐果标准溶液,
