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1、,过氧化氢酶米氏常数的测定,河南科技大学医学院 生物化学与分子生物学教研室,过氧化氢酶米氏常数的测定,生物化学实验,【目的】,【目的】,过氧化氢酶米氏常数的测定,掌握米氏方程及其意义。 掌握过氧化氢酶米氏常数测定的原理、方法和步骤。,【原理】 1. 米氏方程,【原理】,米氏方程：当环境温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应速度v 与底物浓度S的关系符合米氏方程。,Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数,以不同的底物浓度S为横坐标，S/v为纵坐标，将各点连成一直线，并向纵轴方向延长，此延长线在横轴上的截距即为Km值。,2. 汉斯方程,2. 汉斯方程,在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用
2、很大的S，也只能得到趋近于Vm的反应速度，难以达到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。为得到准确的Km值，可以把米氏方程转化为 y = ax + b 的直线方程，然后用图解法求出Km值。本实验采用汉斯作图法(Hanes Plot)求Km值。将米氏方程两边取倒数再乘以S即为汉斯方程：,3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理,本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其Km值和Vm值。,过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2； 反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定； 通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度v； 通过汉斯作图法可求出过氧化氢酶的Km值和Vm值
3、。,说明： KMnO4既是氧化剂，又是指示剂； Mn2+是滴定反应的催化剂。,3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理,操作 1. 肝匀浆制备,【操作】,1. 肝匀浆制备 将小白鼠处死，立即取出肝脏，去除胆囊及结缔组织，用0.45的盐水洗净。 称取1g肝组织加1ml 0.45%盐水放入匀浆器，研磨成匀浆。取上述匀浆，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至1:10。 取1:10的匀浆液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释定容至50ml(1:500)。,2. 反应速度测定,2. 反应速度测定,说明： 试剂加量要准确； 每个三角瓶可分别保温，但要准确计时。 10H2SO4液可事先准备好，到时直接倾入。 KMnO
4、4用量记录精确度：0.01,3. 计算 计算各管底物浓度,3. 计算, 按下式计算各管底物浓度(mmol/L)填入下表, 计算各管反应速度,3. 计算, 按下式计算各管反应速度(mmol/10min)填入下表, (mmol/L) = H2O2浓度(mmol/L) 加入H2O2的体积(L) KMnO4(mmol/L) 消耗的KMnO4的体积(L) 5/2, 计算各管S/v,3. 计算, 计算各管S/v值(10min/L)填入下表, 汉斯作图,3. 计算, 汉斯方程作图求Km值和Vm值,以S为横坐标，S/v 为纵坐标，制作S/v S坐标图。将测定各点连成一直线，并向纵轴方向延长与横轴相交，交点为横
5、截距，即Km 。纵截距为Km / Vm 。 从坐标图查得 Km = 25，即：Km = 25 mmol/L 。 从坐标图查得 Km / Vm = 46，将Km值代入求得：Vm = 0.543 mmol/10min 。,*Excel汉斯作图,Excel 汉氏作图,Km = 25 mmol/L Vm = 0.543 mmol/10min,*Excel双倒数作图,y = 45.786x + 1.8311,Excel 双倒数作图,Km = 25 mmol/L Vm = 0.546 mmol/10min,*Excel-Eadie-Hofstee作图,y = -25.051x + 0.5467,Km = 25 mmol/L Vm = 0.545 mmol/10min,Excel-Eadie-Hofstee 作图,*Excel直线作图,Excel 直线作图,直接从坐标点读出： Km = 25 mmol/L Vm = 0.545 mmol/10min,结果分析讨论,【结果分析讨论】,谢谢,再见,再见,再见,
