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1、PCR技术 在动物传染病诊断中的应用,实验四,聚合酶链式反应,polymerase chain reaction,聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)简称PCR，是一种选择 性体外扩增DNA或RNA的方法。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促 扩增法，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。,模板DNA或RNA特异性引物: sense和 antisenseTaq酶：耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+ PCR缓冲液： 10mmol/LTris-HCl pH8.450mmol/L KClMg2+0.1mg/mL乙酰BSA,PCR体系基本组成成分
2、,模板DNA,引物设计注意事项,引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，两条引物3端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。,5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
3、 两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。,引物设计注意事项,引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。,G值是指dna双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。,引物的设计的总原则
4、：扩增的效率和特异性 长度：1530bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 40-60%） 引物内部不能形成二级结构 两引物间没有互补链存在 3端一定要与模板严格配对 5端可引入突变，加酶切位点等 辅助软件：primer5，Oligo，DNAsis等,PCR反应体系引物,primer5.0操作界面,X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。,PCR反应体系引物浓度计算,一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量
5、。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：,dNTP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mM/L并分装，-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为2.5mM/L。当dNTP终浓度大于50mM/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。,PCR反应体系 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP),Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成
6、等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。,PCR反应体系 Mg2+,TITRATE YOUR Mg2+ CONCENTRATION!,4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 mM,Normally, 1.5mM MgCl2 is optimal Best supplied as separate tube Always vortex tha
7、wed MgCl2 Mg2+ concentration will be affected by the amount of DNA, primers and nucleotides,就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102 -105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1g的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。,PCR反应体系模板,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶
8、K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。,PCR反应体系模板的提取方法,TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min，95 40
9、min， 97 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74下，30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100l PCR反应中，1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭
10、活TaqDNA聚合酶, 灭活TaqDNA聚合酶的方法有：,PCR反应体系TaqDNA聚合酶,(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加热10min。 目前已有直接纯化PCR产物的装备可用。,PCR反应体系 TaqDNA聚合酶灭活方法,缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。TrisCl在20时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmo
11、l/L的二硫苏糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。,PCR反应体系 PCR反应缓冲液,PCR的基本反应步骤,变性 94,延伸 72 ,退火 Tm-5,包括三个基本步骤: 变性(使改变本性):目的双链DNA片段在94下解链; 退火(退火):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; 延伸(延长): DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一
12、条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR的基本反应步骤,在第一轮循环前，在94下变性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶(热启动)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败。因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的
13、损失。,变性,引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性。,退火,延伸反应通常为72，接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20-85。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，TaqD
14、NA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,延伸,当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后，反应中TaqDNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮
15、循环后，扩增水平可达109-1010。,循环次数,扩增产物的量可用下列公式表示:CC0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量，C0 为起始DNA量，P为扩增效率，n为循环次数。 在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。,扩增效率,5 3,3 5,聚 合 酶 链 式 反 应 示 意 图,目的片段,模板,引物对,高温变性,低温退火,中温延伸,不断循环,5,Primer 1,5,Primer 2
16、,5,5,Template DNA,PCR 基本工作原理,PCR反应特点特异性强,引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性,PCR反应特点灵敏度高,PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。,不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,PCR反应特点对标本的纯度要求低,
