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1、2018/9/24,1,第九章 基因工程和基因组学 1基因工程(Gene engineering) 一、基因工程概述1、基因工程的概念 20世纪70年代随着DNA重组技术的发展在遗传学上产生了一门新的分支遗传工程（ Genetics engineering ） 遗传工程:又称遗传操作（Genetic manipulation）,是以分子遗传学为基础，以现代物理、化学等为手段，按照人们设 计的生物蓝图在细胞、染色体和基因等不同水平上，对生物的遗传性状进行定向改造，创造新的生物类型。 广义的遗传工程：包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工 程。 狭义的遗传工程：即基因工程,2018/9/24
2、,2,2.基因工程的发展： 基因工程的产生和发展在遗传学的发展史上是一次大革命，它打破了种、属的界线，可以在生物大系统内交流基因。其发展情况如下： 1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶 酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。 1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来 得到新的DNA分子。 1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。 1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛
3、素投放市场。 1985年，转基因植物获得成功。 1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。 1996年，克隆羊诞生。,2018/9/24,3,美国批准上市的基因工程产品有：人类胰岛素、人类生长因子、白介酸、干扰素、牛型生长激素、疫苗等，并不断有新的品种进入临床应用。 在农业上也有很多应用，如1985年开始转基因作物品种培育，在高梁、水稻、烟草、玉米、棉花等作物上都获得成功。,2018/9/24,4,全世界转基因植物种植面积为：1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年2780万公顷，1999年3990万公顷，2000年4420万公顷，2001年52
4、60万公顷，2002年5000万公顷。,2018/9/24,5,2001年种植面积100万公顷的转基因作物： 大豆（3330万hm2，占全世界转基因作物的63%，均为抗除草剂大豆） 玉米（980万hm2 ， 占 19% ） 棉花（680万hm2 ， 占 13% ） 油菜（270万hm2 ， 占 5% ） 其它还有水稻、小麦、花生、日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等，番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已培育成功。 主要分布在美国（3570万hm2 ）、阿根廷（1180万hm2 ）、加拿大（320万hm2 ）和中国（150万hm2 ）等国。,2018/9/24,6,下图为2001年全世界转基因作物
5、占相应作物种植总面积的比较2001年我国的转基因农作物和林木已达22种，其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验，转基因棉花已经大规模商品化生产。,2018/9/24,7,3内容： 从细胞和组织中分离和纯化DNA；利用能识别特异性DNA 序列的限制性内切酶剪切DNA分子，制 备含有目的基因的DNA片段，或采用酶学和化学合成的方法人工合成基因； 将DNA片段或人工合成的基因与能够自我复制并具有选择标记的载体在体外连接，形成重组DNA分子； 将重组的DNA分子引入受体（宿主）细胞中，使重组DNA分子在受体细胞内复制，产生多个拷贝，即克隆（clone）； 重组
6、DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞中，使子代群体细胞均具有重组的DNA分子的拷贝； 从繁殖的大量细胞群体中筛选和鉴定含有目标基因的重组DNA分的，受体细胞的克隆；. 能从选出的宿主细胞中回收、纯化、和分析克隆的重组的DNA分子；.克隆的基因能够正常表达。,2018/9/24,8,基因工程的主要步骤可概括为： 1.分离或合成目的基因； 2.将带有目标基因的DNA片段与载体DNA体外重组； 3.将重组的DNA分子引入到； 4.重组体克隆的筛选和鉴定。,2018/9/24,9,二、限制性内切核酸酶： 限制性内切核酸酶，是一种核酸水解酶，主要从细菌中分离得到，这些酶能识别特定的核苷酸序列， 在细胞
7、中主要是用来水解外来DNA分子而保护自身的，所以称之为限制性内切酶。是基因工程的常用工具以交错方式切断DNA双链， 产生二个相同单链粘性末端。 在适宜的条件下，两个DNA 分子的黏性末端连接成双链 的重组DNA分子。,2018/9/24,10,限制性内切酶的命名： 根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； . EcoR I 来自大肠杆菌（Escherichia coli）； . Hind 来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。,2018/9/24,11,限制性内切酶的类别： 根据限制性内切酶的作用特点，可分为两类：第类酶、第类酶 第类酶 ：如EcoB(大肠杆菌B株)
8、、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300，000)，作 用时需ATP、Mg+等辅助因子。由于这类酶的切割部位无特异性，是随机的，每隔一段DNA 序列随机切割双链DNA分子，切割点不固定，所以在基因工程中很少应用。 第类酶（）： 如EcoR I(大肠杆菌)、Hind (嗜血杆菌)，分子量较小(约 20，000-100，000)作用时需要有Mg+存在。这类酶的切割部位有特异性，可准确切割DNA双链的特异序列，因此在基因工程中广泛应用。,2018/9/24,12,这类酶的切割点是对称序列。 如回文对称序列（palindrome，又称反向重复序列，即从两个方向阅读，其序列相同的序列）。识别特定的
9、碱基序列，交错切割产生二个粘性末端（sticky ends），如BamH I、 Pst I ：两个DNA分子的黏性末端连接成双链的重组DNA分子。,2018/9/24,13,Sma I 是另一种类型，这种酶切割DNA双链后产生二个平齐末端（blunt ends），如两个平齐末端 也可以在DNA连接酶的作用下连接成 重组DNA分子。 P217 表9-1 列出了部分常用的限制性内切酶,2018/9/24,14,三、载体（vector）：载体是将“目的”基因即重组DNA分子导入受体细胞的运载工具。 DNA片段+适合的载体DNA 重组DNA 在载体DNA的运载下，高效率地进入宿主细胞，并在其中进行复制
10、、扩增、克隆出许多拷贝。 DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等，现在使用的载体都是采用基因工程的方法构建的。 载体的条件： .具有复制原点，能自我复制，并能带动携带的外源DNA一起复制。 .具多克隆位点(multiple cloningsite，MCS 或polylinker region)，即有多种限制酶的切点；且切点不存在于复制原点或抗性选择标记内，即切点不影响复制和标记性状的表现。 .至少有一个选择标记基因，便于鉴定进入宿主细胞与否，如抗生素基因或某种酶的基因，而宿主细胞没有这些基因。 .易从宿主细胞中回收克隆。,2018/9/24,15,根据载体的作用，可把载体分为
11、三类：克隆载体、表达载体和穿梭载体。 克隆载体：是指主要用于在受体细胞中扩增目的基因的一类载体，一般具有较低的分子量，其复制不是处于寄主的严密控制之下，较高的拷贝数和松弛型复制子，主要有细菌质粒或与其他质粒、噬菌体及其真核生物病毒的DNA重组构建。,2018/9/24,16,表达载体：使目的基因在受体细胞中表达的载体。作为表达载体可将重组DNA导入适合的受体细胞，使其所载荷的基因能够复制、转录和翻译。这类载体具有强启动子等调控序列；有使RNA聚合酶只转录克隆基因而不能转录无关序列 的强终止子；其次，启动子还应是受控制的即只在诱导时才进行转录，以保证转录效率和防止给细胞造成不利影响；此外所产生的
12、 mRNA必须具有翻译的起始信号AUG 和SD序列，在启动子与目的基因或SD序列与目的基因的起始密码子AUG 之间还要有正常间隔，以不造成移码，所转录的mRNA可翻译成目的蛋白，而且这种蛋白在寄主细胞中可保持稳定且便于提取。迄今，已设计和构建了一系列以原核启动子代替真核启动子的质粒表达载体，如大肠杆菌乳糖操纵子、色氨酸启动子德Trp启动子以及噬菌体PI启动子等分别构建的启动子。,2018/9/24,17,穿梭载体：又称双功能载体，具有克隆载体和表达载体两种作用，能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭。即能在在原核生物细胞中扩增，又能在真核生物细胞中复制和表达。主要用于在原核细胞和在真核细胞之间进
13、行基因转移。通常是将载体和待克隆的真核生物DNA 片段现在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。这类载体必须即具有细菌的复制原点或质粒的复制原点，又含有真核生物体的复制原点，如SV40复制原点或酵母的自主复制系列 （autonomously reolicoting sequence ,ARS),此外这类载体还应具有可资利用的酶切位点和合适的筛选指标，这样的载体即可往来穿梭于原核细胞和在真核细胞之间进行基因转移。穿梭载体不仅可把目的基因引入真核细胞，而且还可以从真核细胞染色体上回收基因或DNA片段。,2018/9/24,18,下面是一些常用的载体：、细菌质粒 ： 质粒是
14、细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子，是。 质粒具有重组表型检测标记，可检测是否携带外源DNA片段。 可用于克隆分子量小于10kb(1kb=1000bp)的外源DNA片段下面左图为pUC18质粒，右图为pUC19质粒。,2018/9/24,19,如pUC18质粒具有以下特点： . 分子量小，可接受较大外源片段； . 拷贝数多，500个细胞； . 克隆位点的酶切位点多，克隆方便； . 具有用于检测重组质粒的选择标记（如互补的显色表型）。,2018/9/24,20,、噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因
15、簇，两端为DNA左、 右臂。 中间基因簇可被外源DNA替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15-23kb外源DNA片段， 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： * 不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖； * 携带大片段外源DNA分子，占总量25%时仍不失活。 1. 噬菌体2. 噬菌体DNA3. 噬菌体DNA 中间基 因簇4. 噬菌体DNA两个臂5. 外源DNA片段将连接物体外包装感染细菌，制备基因库6. 携带有重组DNA分子 的噬菌体,2018/9/24,21,、柯斯质粒(cosmid)：（克隆载体） 噬菌体DNA部分细菌质粒DNA序列 柯斯质粒。 有噬菌体cos序列、细菌质粒
16、复制原点、抗生素抗性标记。 这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的外源DNA片段 克隆真核生物基因。 一个长片段DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。,2018/9/24,22,、穿梭载体（shuttle vectors）： 指能在两种不同生物中复制的载体。 如能在原核生物(如E.coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。 穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列(Auto-nomously replicating sequence,ARS)以及两者的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母中用于基因表达分析。 酵母菌的YEp (yeast episomaplasmid)等系列载体均是穿梭载体。,
