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1、自噬抑制剂3-MA 克服肝癌细胞索拉菲尼耐药的作用及机制研究,专业：普通外科导师：王世明 教授硕士研究生：梁源,立论依据,研究现状,研究方案,目录,1,2,3,4,研究基础,5,参考文献,肝癌肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，我国已成为全球肝癌发病率最高和死亡最多的国家。我国肝癌发病约347万人年，占到全球的55；而死亡323万人，占全球的45，因此，肝癌是一种具有“中国特色”的癌症，严重地威胁人民健康和生命。,立论依据,研究背景（一）,A期（早期）,B期 （中期）,C期（晚期),D期（终末期）,53.9,27.1,15.3,2.6,按照BCLC分期，肝癌患者分布情况,调查结果： 诊断为肝癌患
2、者中53为晚期,研究背景（二） 索拉菲尼近年来，分子靶向药物治疗肝癌已成为新的研究热点。其中索拉非尼(Sorafenib，商品名：Nexavar，多吉美)治疗肝癌在临床研究中取得了突破性进展，能够有效地阻止病情恶化，明显地延长晚期肝癌患者的生存时间，成为第一个可以显著延长晚期肝癌患者生存期的系统治疗药物和新标准,立论依据,消融术,0期 PST 0, ChildPugh A级,极早期（0） 1 HCC 2cm 原位癌,早期 (A) 1个 HCC或3个结节 2, ChildPugh C级,HCC,中期 (B) 多结节， PST 0,AC期 PST 02, ChildPugh AB级,索拉非尼,BC
3、LC分期和治疗策略(2010) 推荐索拉非尼作为晚期HCC标准治疗,Alejandro F,Maria ER,Carlos R,et al.Semin Liver Dis .2010;30:61-74.,索拉非尼被各大指南推荐为标准用药,美国国家综合癌症网（NCCN）肝癌临床实践指南,美国肝病研究协会（AASLD）肝癌临床治疗指南,巴塞罗那（BCLC）肝癌分期和治疗策略,亚太肝病学会（APASL）肝癌治疗指南,原发性肝癌规范化诊治专家共识（中国）,日本肝脏病学会（JSH）共识肝癌治疗策略,欧洲（EASL-EORTC）肝癌临床实践指南,索拉非尼,34. Li Liu, et al. Cancer
4、 Res. 2006;66:11851-58 .,抑制血管生成 VEGF PDGF,抑制肿瘤细胞增殖 （抑制种子生长）,残余肿瘤细胞 微小病灶 循环肿瘤细胞,抑制肿瘤血管生成 （使土壤贫瘠）,索拉非尼的双重抗肿瘤作用,索拉菲尼抗肿瘤作用,索拉菲尼通过抑制PI3KAktmTORp70S6K信号通路的磷酸化。促进凋亡，同时激活自噬性程序性死亡。,活化JNK途径诱导肝癌细胞发生自噬性细胞死亡,索拉菲尼,型程序性细胞死亡：凋亡,型程序性细胞死亡：自噬,坏死,细胞死亡方式,研究背景（三）自噬与凋亡的关系,自噬模式图,研究背景,研究背景,坏死,凋亡,自噬及凋亡的关系,1自噬抑制凋亡：自噬通过降解受损蛋白损
5、伤等途径抑制凋亡。 2自噬促进凋亡：自噬自身并不引起细胞死亡，但它为凋亡小体的形成和吞噬作用提供能量，从而促进凋亡的发生。 3自噬与凋亡共存并可相互转换：在自噬晚期使用特异性自噬抑制剂则使自噬性死亡转向凋亡，有文献报道imatinib可以致恶性神经胶质瘤细胞发生自噬性死亡，然而在自噬晚期使用自噬抑制剂可使自噬性死亡转向凋亡，而当细胞凋亡被抑制剂阻断细胞则转向自噬，此时不论抑制凋亡还是自噬，细胞均转变为另一条途径的细胞死亡。,研究背景,自噬对肿瘤的双重作用,研究背景,目前对自噬对肿瘤中到底是其抑制还是保护作用仍是倍具争议。 （1）一方面，自噬可以杀死肿瘤细胞。 （2）另一方面，自噬可以保护肿瘤细
6、胞。由于肿瘤细胞具有高代谢的特点，肿瘤持续快速增大营养供应不足，自噬被激活将损伤的细胞器及蛋白降解成可利用的活性成分，供给给肿瘤细胞来度过这一危机。这一过程与肝癌细胞对索拉菲尼耐药形成相关。,凋亡,自噬,自噬,肝癌索拉菲尼耐药机制（一）,凋亡,自噬激活后，一方面，降解受损细胞器及蛋白为肿瘤提供营养。另一方面抑制凋亡，减少肿瘤细胞坏死。使得癌细胞存活。自噬对肿瘤形成了保护作用。该过程降低了肝癌细胞对于索拉菲尼的敏感性。我们推测这是是肝癌细胞对索拉菲尼耐药形成原因之一。,3MA,肿瘤持续快速增大营养供应不足,1.索拉菲尼通过抑制P13KAktmTORp70S6K信号通路的磷酸化。促进凋亡，激活自噬
7、。 2.活化JNK途径诱导肝癌细胞发生自噬性细胞死亡,激活,早期,晚期,抑制,研究现状,干预,2.PI3k/Akt通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性耐药PI3k/Akt是促进细胞自噬发生的重要传导通路。PI3k可被生长因子等刺激物激活生成PIP3，再激活其下游的Atk蛋白继而磷酸化其一系列底物，从而达到对细自噬的调控。该通路的激活与肿瘤细胞的耐药性的产生密切相关。研究发现耐药细胞中pAkt有明显上调。而抑制Akt的表达，则可逆转耐药细胞对索拉非尼的耐药性。该研究结果表明，PI3k/Akt通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性耐药。,研究现状,肝癌索拉菲尼耐药机制（二）,.,本研究构
8、建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型，观察自噬抑制剂3-MA对裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型皮下移植瘤的作用。并检测 PI3KAKT途径及JNK途径相关蛋白水平。探讨自噬抑制剂3-MA是否通过上述途径抑制自噬，代偿性激活凋亡，增加耐药肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性，对耐药性形成克服或逆转，从而抑制肿瘤生长，为临床上治疗对索菲拉尼耐药的肝癌患者的用药提供实验依据。,研究目标,肝癌索拉菲尼耐药细胞株的体外培养,建立移植瘤裸鼠模型,空白对照组,索拉菲尼组,3MA+索拉菲尼组,低剂量组,高剂量组,高剂量组,低剂量组,肿瘤形态学观察,观察结束后取肿瘤组织及细胞组织,绘制体质量曲 线,称取肿瘤组织重量计算抑瘤率,W
9、estern blotting 检测pAtk、pJNK、Caspase3 表达,免疫组织化学染色法检测pAk 、pJNK,透射电镜观察自噬体及免疫荧光检测MAP1-LC3 噬水平,结果分析及统计处理,研究内容及技术路线图,（1）统计数据用SPSS20.0 软件包进行分析。 （2）实验数据均以均数标准差表示。 （3）采用单因素方差分析。,统计方法,（1）成功建立人肝癌细胞索菲拉尼耐药株鼠移植瘤的动物模型（2）需继续查阅大量文献确定小鼠灌胃给药浓度及剂量;（3）熟练掌握干预动物给药方式。（4）检测各个指标的实验技术方法需熟练掌握；,拟解决关键问题,实验室及实验器材等完备、试剂的完备，已基本掌握动物
10、饲养、免疫组化等试验操作的基本要领。,已参阅大量相关文献立论依据充分，且经费已经落实,导师带领的团队进行了大量关于自噬的研究可作为前期研究工作积累,Product A,研究基础及 可行性分析,预期研究成果,2,3,1,索拉菲尼与自噬抑制剂3-MA联用可克服肝癌细胞对索拉菲尼的耐药，明显增强索拉菲尼治疗肝癌效果,自噬抑制剂可逆转肝癌细胞对索拉菲尼耐药，可能通过抑制与自噬有关的PI3KAKT途径及JNK途径。,发表1-2篇论文,预期研究成果,提出了一种新的具有潜在应用价值的辅助治疗肝癌的新思路。,裸鼠体内水平研究自噬克服肝癌细胞索拉菲尼耐药作用及机制研鲜有报道,1,2,本课题创新之处,2015.0
11、1 -2014.04,2015.06-2015.08,查阅文献 撰写综述及开题报告,培养细胞,裸鼠造模。,各组各项指标的测定 统计分析,2015.08-2015.10,2015.04-2015.06,撰写毕业论文 准备答辩,研究计划及预期进展,支出科目 金额（万元） 计算根据及理由合计 0.6 科研业务费 0.02 文献检索、打印、论文装订实验材料费 0.5 实验试剂、材料、药品仪器设备费 协作费 0.05 指标检测研究组织实施费 0.03 日常研究组织.,经费预算,1. Wilson, G.S., et al., Tumoricidal effects of the JAK inhibito
12、r Ruxolitinib (INC424) on hepatocellular carcinoma in vitro. Cancer Letters, 2013. 341(2): p. 224-230.2. Chen, K.F., et al., Activation of Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Signaling Pathway Mediates Acquired Resistance to Sorafenib in Hepatocellular Carcinoma Cells. Journal of Pharmacology and Expe
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