细胞工程第三章

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1、,第三章 植物组织与细胞培养,生物工程系,山东科技大学,主讲 邹玉红,第一节、植物组织培养与 细胞培养的区别,1979年,国际组织培养协会专业术语委员会将两者区分，组织培养 是指从体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织细胞培养 是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织,对于植物 组织培养 常见的是用于植物快速繁殖的组培技术。 细胞培养 主要有以生产次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。,第一节、植物组织培养与 细胞培养的区别,19世纪30年代，细胞学说。1902年，德国，哈伯兰德，植物组织培养之父植物细胞离体培养实验,第二节、发展历史

2、,他用高等植物的叶肉细胞、髓细胞、表皮细胞等多种细胞放置在他自己配制的营养物质中（人工配制的营养物），称为培养基，这些细胞在培养基上可生存相当长一段时间，但他只发现有些细胞增大，却始终没有看到细胞分裂和增殖。,1943年，美国，White，植物细胞具有全能性 认为：每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力 烟草的茎段形成层细胞和胡萝卜根的小块组织-愈伤组织（未培养出芽和根）,第二节、发展历史,第二节、发展历史,1934年，荷兰植物学家温特发现了生长素吲哚乙酸(萘乙酸，2，4-二氯苯氧乙酸相继发现),第二节、发展历史,细胞分裂素用于植物组织和细胞培养推动了技术的发展，成为20世

3、纪50年代植物组织和细胞培养的一大突破。它能促进细胞团产生不定芽或直接从组织表面形成不定芽。并能促进侧芽的生长。细胞分裂素与生长素的比例调控植物组织的形态发生和细胞分化比值高时产生芽，低时产生根，比值适中时维持原组织生长而不分化,第二节、发展历史,1958年 斯图尔德用胡萝卜根愈伤组织获得了单细胞，并且成功形成胚状体发育成完整植株，这是世界上首次通过实验证实了植物细胞具有全能性，为植物组织培养技术程序奠定了重要基础。,第二节、发展历史,20世纪60年代，植物组织培养开始走向大规模的应用阶段。莫雷尔采用兰属的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。经过茎尖原球茎小植株的方式而再生的。 按莫雷尔

4、的方法： 1个半花茎尖繁殖出400万株（具有相同遗传性的健康植物）之后这一技术导致欧洲、美洲和东南亚许多国家兰花工业的兴起 。,第二节、发展历史,莫雷尔用兰花假鳞茎的茎尖分生组织来进行营养繁殖，培养出兰花无病毒幼苗。他发现蕙兰茎尖分生组织。经过离体培养，可以逐渐增大而形成原球茎体，与兰花胚胎正常发育出来的器官相似。经过两个月的培养，这种类原球茎体出芽，长出相同的构造。经过分割，重复培养可以大量增殖，繁殖出大量兰花试管苗,在20世纪30年代，我国的科学家罗宗洛和李继侗就已成为远东植物培养的先驱者。罗宗洛主要从事离体根尖的培养李继恫发现银杏胚乳提取物对离体胚发育的促进作用。进入80年代，我国进入大

5、规模应用阶段，重点是无性系的快速繁殖，目前在番茄、辣椒、生菜、人参、花卉等实行工厂化生产。,第二节、发展历史,第二节、发展历史,植物生理学家。我国现代植物生理学奠基人之一。研究工作涉及植物细胞质胶体、无机营养及离子吸收、组织培养、生长物质、微量元素、水分及抗性生理、辐射生理、细胞生物学等领域，并培养了不少上述诸方面的人才。在国内率先开展根尖组织培养研究。证明铵能作为植物氮源，为铵盐化肥的肥效评价及正确使用提供了科学依据。根据植物抗性研究提出的措施，为防止海南岛橡胶树寒害和苏北沿海营造防风林的育苗死苗，作出了贡献。曾创办中国实验生物学杂志、植物学汇报及植物生理学报。,罗宗洛,第二节、发展历史,1

6、898年8月2日 出生于浙江省黄岩县。 1925年 日本北海道帝国大学毕业。 1930年 获北海道帝国大学大学院农学博士学位。 19301932年 任中山大学生物系教授、主任。 19321933年 任暨南大学教授。 19331940年 任中央大学教授。 19401944年 任浙江大学教授。 19441949年 任中央研究院植物研究所所长。 19451946年 接收台湾大学、代理台湾大学校长。19491952年 任中国科学院实验生物研究所研究员19531978年 任中国科学院植物生理研究所所长。 1978年10月26日 病逝于上海中山医院。,第二节、发展历史,李继侗，植物学家，生态学家，教育家。

7、我国植物生理学的开拓者，植物生态学与地植物学的奠基人之一。在森林生态学、植物生态学与地植物学研究方面取得重要成就，在植物生理学研究方面首先发现光合作用的瞬时效应；为我国培养了一批植物学人才 李继侗1921年发表的青岛森林调查记，是我国最早的森林生态学文献之一 同年考取清华学校公费留美，入耶鲁大学林学研究院作研究生，1923年获硕士学位，1925年获博士学位，,第二节、发展历史,在美国耶鲁大学林学研究院，受业于美国知名的造林学教授JWToumey，他特别注意立地学（Slanddortlehre）（即现在通称的森林生态学）的研究，在Toumey教授的影响下，完成森林覆被对土壤温度的影响（Soil

8、Temperature as Influenced by Forest Cover）的博士论文，无论从学术和技术方面，都达到当时的最高水平。土壤温度作为立地因子在造林工作上有重要的作用，对林木种籽在林地上的保存、萌发和幼苗、幼树的成长发育都有重要影响，是造林育苗和更新工作需要进行深入研究的基本问题之一。在本世纪20年代，这方面工作不多，而在美国是一个空白点，李继侗在这项研究中改进了前人的观察方法，观测细致，数据丰富而全面，使人对森林覆被如何影响从表面到不同深度土壤温度变化的规律有了更可信的知识，这是当时森林立地学方面的一项突出成就。,第二节、发展历史,1897年8月24日 生于江苏省兴化县。

9、19161918年 圣约翰大学学生。 19181921年 南京金陵大学林科毕业。 19211923年 美国耶鲁大学林学研究院获硕士学位。 19231925年 耶鲁大学林学研究院获博士学位。 19251926年 任金陵大学教授。 19261929年 任南开大学生物系教授。 19291952年 任清华大学生物系教授。 19521957年 任北京大学生物系教授，中国科学院植物研究所兼职研究员。 19571961年 任内蒙古大学教授、副校长。 1961年12月12日 病逝于内蒙古自治区呼和浩特市。,意义： 进行植物组织培养，只需要少量的材料就能够获得大量的植株，不仅可节约大量的种子、肥料，而且还节约了

10、大量的耕地，因此可以在工厂中进行育苗。组织培养技术是农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，它不仅是农业继续发展的基础。而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域。被誉为农业发展史上的第四次绿色革命。,第二节、发展历史,一、定义与基本原理植物组织培养是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织(如花药组织)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上、给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽或者长成新的完整植株的一种实验技术。,第三节 植物组织与器官培养,根尖、茎尖、叶、花、,体细胞、生殖细胞等,由于是在试管内培养，而且培养的是脱离植株母体的培养物，因此也被称为植物

11、离体培养或试管培养，由此培育的植物也称之为”试管植物”。,一、定义与基本原理,(一)全能细胞全能细胞是能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同生物体。 (二)愈伤组织愈伤组织是由外植体组织增生的细胞产生的 一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。,二、几个重要概念,二、几个重要概念,草莓花药愈伤组织,魔芋愈伤组织,二、几个重要概念,愈伤组织 诱导种子萌发,丹草愈伤组织,这些细胞大小、形状、液泡化程度、胞质含量、细胞壁特性等通常具有很大的差异，愈伤组织细胞是分化的，但还没形成组织上的结构，因此愈伤组织培养过程中没有明显的组织或器官上的分化。愈伤组

12、织 用继代培养的方式长期保存 通过悬浮培养而迅速增殖，用作无性系 用作原生质体培养时原生质体的来源,二、几个重要概念,(三)外植体外植体 是指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官组织、细胞和原生质体等。(四)继代培养继代培养 是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。这种转移称为继代培养或传代培养。,二、几个重要概念,多数情况下植物细胞或组织培养是希望得到再生植株。经过以下两个步骤：(1)培养的植物细胞或组织的脱分化，形成愈伤组织。(2)由新形成的愈伤组织形成一些分生细胞团，随后由其分化成不同

13、的器官原基。,三、 细胞分化和形态建成,四、植物组织培养的基本步骤,组织培养根据外植体的不同,植株培养、 器官培养 (植物的根、茎、叶、花药等)、 组织培养(愈伤组织),四、植物组织培养的基本步骤,组织培养根据操作方式不同,这些培养物需在适宜的培养基中和一定的温度和光照条件下生长发育。培养基成分包括大量或微量无机盐、维生素和氨基酸。,四、植物组织培养的基本步骤,四、植物组织培养的基本步骤,四、植物组织培养的基本步骤,四、植物组织培养的基本步骤,以胡萝卜为例 (一)培养材料的采集 (二)培养材料的消毒 (三)制备外植体 （四)接种和培养 （五）根的诱导 （六)组培苗的练苗移栽,四、植物组织培养的

14、基本步骤,以胡萝卜为例 (一)培养材料的采集从理论上讲、植物具有全能性的细胞有三类(1)受精卵(2)发育中的分生组织细胞：可取自分生组织、根尖、嫩茎、幼叶、花等，用它们进行无性繁殖能将一些植物无法通过有性繁殖保存的遗传性状保留下来。(3)雌雄配子及单倍体细胞：对它们进行组织培养可以使基因表达充分，隐性基因不受抑制；利用它们可以直接选择所需性状,经染色体加倍，就能直接用于生产领域。,四、植物组织培养的基本步骤,在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5cm左右。如果为培养无病毒苗、通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1cm以下。,(二)培养材料的消毒1)先将材料用自来水冲洗干净，

15、最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。 2)在无菌环境中将材料放入70酒精中浸泡30-60s。 3)再将材料移入漂白粉饱和液或0.01升汞水中消毒10min。 4)取出后用无菌水冲洗三四次。,(三)制备外植体在无菌的环境下，将己消毒的材料用无菌刀、剪、镊等，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳(叶片则不需剥皮)。然后切成0205cm厚的小片；在操作中严禁用手触摸材料。 （四)接种和培养(1)接种：在无菌坏境下，将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶接种410个。(2)封口：接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。,(3)温度：培养基大

16、多应保持在25左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。(4)增殖：在新梢等形成后需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中(增殖培养基一般在分化培养基上加以改良)，增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。,（五）根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养、1个月后即可获得健壮根系。,（六)组培苗的练苗移栽试管苗进入自然环境前必须进行炼苗，一般先将培养容器打开，在室内自然光照下放3天，然后取出小苗。用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入一准备好的基质中。移栽前要适当遮荫、加强水分管理，保持较高的空气湿度，但不要过湿，以防烂苗。,五、愈伤组织培养（一）愈伤组织培养的基本过程 1、愈伤组织的形成 2、愈伤组织的生长 3、愈伤组织的分化和形态的发生,五、愈伤组织培养1、愈伤组织的形成由外植体或单个细胞形成愈伤组织一般要经过三个步骤：(1)启动期(或诱导期)：主要是指细胞或原生质体准备分裂的时期，需要采用合适的诱导剂。如NAA(萘乙酸)、LAA(吲哚乙酸)、或细胞分裂素。,