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1、细胞融合实验,,概念 促融合剂与融合技术 应用与意义,重点,一 定义： Cell fusion,细胞融合：(Cell fusion)又称 体细胞杂交 （somatic hybridization） 是指将不同来源的原生质体 (除去细胞壁的细胞)相融合， 将两个或多个细胞合并成 一个细胞的技术。,人心肌细胞,人肝脏细胞,种内杂交细胞,人细胞,鼠细胞,种间杂交细胞,在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。种内杂交细胞（intraspecific hybrid cell）:同种细胞融合而成的细胞种间杂交细胞（interspec
2、ific hybrid cell）: 不同种的细胞融合而成的细胞,非对称细胞融合（asymmetric fusion）：利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。,细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：1.物理方法，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活； 2.化学方法，核失活碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活罗丹明（R6G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。,动物克隆,上海第二医科大学陈莹博士,2003年，她将一5岁男孩的包皮细胞与一只已去除细胞核 的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。,二细胞融合的原理,荧光标
3、记的小鼠细胞和人细胞融合实验,将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合, 人的抗体与发红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合；,显微镜下的细胞融合过程,细胞融合的过程,细胞互相靠近,细胞膜融合,细胞桥形成,细胞质融合,细胞核融合,细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合主要步骤。细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥。,细胞融合过程中两个细胞膜的变化,形成细胞桥的具体变化,细胞融合分为两种： 1.自发细胞融合 2.人工诱导细胞融合,（1）自发细胞融合,自发细胞融合（spontaneous c
4、ell fusion）是在未施加任何诱导条件的情况下所发生的细胞融合现象。,自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要有以下几种情况：1. 精子和卵子受精2. 肌管的形成3. 胚胎着床4. 巨细胞的形成5. 破骨细胞的形成6. 肿瘤细胞融合,（2）诱导细胞融合,人工诱导细胞融合是在人为条件下发生的细胞融合现象,常用的诱导方法有三种：1. 生物法（病毒诱导法等）2. 化学法（PEG诱导法、Ca 2+诱导法、溶血卵磷脂诱导法等）3. 物理法（电诱导法等）,1.病毒诱导法,常用的病毒：仙台病毒（Sendal virus), 又称日本血凝病毒 （Hemagglutinating virus of
5、Japan,HVJ）属于副粘液病毒科，RNA病毒，圆球形1962年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞融合。,病毒促使细胞融合两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透 - 细胞核互相融合 ，进入正常的细胞分裂途径，杂种子细胞。,2化学法（聚乙二醇）,PEG: 聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG） 分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH 性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、沉淀蛋白质的作用分子量 1000-6000u，可作诱融剂。,20世纪70年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合,分子量小的PEG，融合效应
6、差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。pH偏碱时融合效应最高。 用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50，pH8.0pH8.2,聚乙二醇,普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂 类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合,基本原理,聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商品名卡波蜡(Carbowax)。,聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合,原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子
7、的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。,融合过程中应注意 事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。 原生质体的密度应在105个mL左右，两种原生质体按1：1等量混合。 常用PEG的分子量通常为40006000，加热熔化与Eagle溶液配成50(WV)浓度(小分子质量的PEG配成55浓度)。加入PEG后，24培育1020min 注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓加入高pH、高钙离子溶液15min后用冲洗液清洗，离心收集
8、原生质体。,3.物理法一电融合诱导法,1981年，Scheurich和Zimmermann发明了电诱导细胞融合。,电融合槽,在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。,细胞电融合,原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1100MHz和1001000V/cm的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向发生双向电泳，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。,+,-,+,-,+,-,+,-,-,+
9、,偶极子,电诱导法原理,+,-,-,+,双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。,原生质体电融合过程,1）在高频电流电场下的相互接触。 2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质体融合完成。,注意事项,1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。 2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。,优点：,融合率高，达7080，甚至100 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂
10、种细胞重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。,融合指数（fusion index）: 反映细胞融合的效率有两种计算方法： 1.FI=（对照组细胞数-试验组细胞数）/试验组细胞数2.FI=多核细胞中的细胞核数/所有细胞中的细胞核数,不同细胞融合的条件及其主要应用,来源 前处理 融合的方法 主要应用 动物细胞 不需 仙台病毒,PEG ，电融合 生产单克隆抗体 植物细胞 脱壁 PEG,电融合 创造植物新品种 微生物细胞 脱壁 PEG, 高产优质新菌种,A,A,B,B,A,A,B,B,B,A,A,B,同核体,同核体,异核体（杂交细胞）,未融合
11、,未融合,加入融合剂,融合细胞的类型,同核体：由同一亲本细胞融合而来异核体： （heterokaryon）有不同亲本细胞融合而来异核体其细胞膜融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核。,动物细胞融合影响因素,动物细胞融合中，除促融剂外，其他如细胞性质、温度、pH、离子强度及离子种类等均全影响细胞融合效率。 亲本细胞表面性质影响较大细胞种类不同，融合效果也不同，如腹水癌及株化细胞较易融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导-腹水癌细胞融合时，于37 振摇时易于融合，且融合效率与病毒量呈正比。但在34振摇则融合率下降。在37时不振摇则-不融合。,细
12、胞融合过程中，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于20时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件也可融合。 有些细胞融合时需要Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生变化。实验表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等离子可代替Ca2+，但有效浓度较Ca2+大的多。融合时最适合的离子强度一般为0.1mol/L。 最适合的pH为7.4-7.8之间，在此范围之外，融合率均较低。,比较常用的杂种细胞筛选方法,1遗传互补筛选法： 2营养互补筛选： 3温度敏感筛选法,1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。亲本A：HGPRT- /TK+
13、亲本B：HGPRT+ / TK- 杂交细胞：HGPRT+ / TK+ 在HAT培养基中杂交细胞存活，A、B死亡,2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。,3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：低温敏感突变型，可在低温下生长，在高温下死亡。 亲本二：高温敏感突变型，可在高温下生长
14、，在低温下死亡。 杂种细胞能在高温和低温下生长。,细胞融合的应用,1.用于基因定位 2.用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗 2.用于动物育种 3.用于细胞治疗 4.用于生产单克隆抗体 5.用于研究核质关系和肿瘤发生机制,细胞融合应用,一. 单克隆抗体 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体 的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 “for the discovery of the principle for production o
15、f monoclonal antibodies“,Georges J.F. Koehler Federal Republic of Germany Basel Institute for Immunology Basel, Switzerland b. 1946 d. 1995,Car Milstein Argentina and United Kingdom MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom b. 1927(in Bahia Blanca, Argentina) d. 2002,科莱尔,米尔斯坦,单克隆
16、抗体的概念,单: 单个细胞克隆: 无性繁殖抗体: 化学性质单一、特异性强,亲本细胞的准备,细胞融合,杂交瘤细胞的筛选,可分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选,杂交瘤细胞的克隆化培养,单克隆抗体的生产和纯化,生 产 过 程,单克隆抗体的大量制备过程,一 细胞融合前准备 (一)动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备在腹腔免疫12次后的24周，于融合前34天加强免疫一次，这样可以使抗原最近激活的B淋巴细胞定位于脾脏，也使记忆细胞处在激活与分裂状态。许多资料结果表明，脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤的最佳时间，是在抗体形成高峰之前，而不是在抗体形成高峰期。可溶性抗原的免疫量常为10-100ug，经皮下或腹腔注射免疫1-2次（间隔2-3周），3周后50-500ug抗原加强免疫，加强免疫一定要静脉注射或腹腔内注射，确保抗原到达脾脏。细胞抗原常用2 107用细胞腹腔注射，不需佐剂。 一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。,
