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1、2018/9/23,1,Radionuclide Tracing Technique,放射性核素示踪技术,核医学教研室,2018/9/23,2,教学目的,【掌握】放射核素示踪技术定义、原理。 【熟悉】1、放射性核素示踪技术的特点。2、核素示踪实验的基本类型。3、核素示踪实验的方法学。 【了解】常见的核素示踪技术类型及其原理和应用。,2018/9/23,3,重点与难点,重点核素示踪技术的原理 难点1、核素示踪技术的原理2、核素示踪实验的方法学3、常见的核素示踪技术的类型及原理,2018/9/23,4,Introduction 概 述,放射性核素示踪技术是核医学诊断与研究的方法学基础。 核医学任何
2、诊断技术和方法都是建立在示踪技术的基础之上的。 没有示踪原理就没有核医学。,2018/9/23,5,什么是示踪技术？ What is tracing technique?,什么是示踪？什么是放射性核素示踪技术？,2018/9/23,6,1923年 Hevesy 212Pb植物不同部位铅含量32P磷在生物体内代谢 1952年 Hershey 32P、35S DNA遗传信息 1959年 Berson、Yalow RIA Meselson、Stahl DNA半保留复制RNA-DNA逆转录、遗传的三联密码、细胞周期、微量物质测量等均离不开示踪技术。,2018/9/23,7,第一节 核素示踪原理与设计,
3、2018/9/23,8,为什么用放射性核素作为示踪剂？,2018/9/23,9,子代,分离蛋白质外壳及DNA内核，并测量放射性,蛋白质外壳无放射性，DNA上有放射性！,DNA是遗传物质！,2018/9/23,10,一、示踪原理（ Principle ）,1、示踪剂与被示踪物的不可区分性（同一性） 放射性核素或标记化合物（示踪剂）与相对应的同位素和化合物（被示踪物）具有相同的化学和生物学特性，同样参与转化过程，因此基本上能够反映被研究物质的行为。被标记的物质也能代表非标记物的行为。,2018/9/23,11,2、示踪剂的可测性（可测性） 放射性核素能自发地放射出射线。利用高灵敏度的仪器可对示踪剂
4、进行精确的定量、定位、定性探测。动态观察各种物质在生物体内的量变规律。,一、示踪原理（ Principle ）,2018/9/23,12,二、示踪实验设计要点,1、科学选择示踪剂 2、防止实验过程中的交叉污染 3、注意安全防护 4、妥善处理放射性废物,2018/9/23,13,1、科学选择示踪剂,（1）半衰期 （2）辐射类型和射线能量 （3）示踪原子标记位置 （4）放射化学纯度 （5）放射性比活度,2018/9/23,14,（1）半衰期,根据实验周期，选择合适半衰期的放射性核素。半衰期应足够长，以满足实验周期的要求；同时又要足够短，以便于放射性废物的处理。,2018/9/23,15,（2）辐射
5、类型和射线能量,辐射类型：射线发射体核素半衰期极长，毒性大， 射线测量困难，通常很少用；射线和射线测量较容易， 常采用。发射射线的核素通常用于体外示踪实验；发射射线的核素则体内、体外示踪实验均可使用；而体内示踪实验因射线穿透力强，多采用。 射线能量：在满足实验要求的情况下，尽可能用发射低能射线的放射性核素，以方便防护。,2018/9/23,16,（3）示踪原子标记位置,研究物质转运规律时，追踪观察的是示踪物的去向，故只要求标记原子牢固即可。 而研究物质时，示踪原子的标记位置应固定。如研究氨基酸脱羧基时，示踪原子应标记在羧基上。,2018/9/23,17,（4）放射化学纯度,为避免不同放射性示踪
6、剂非标记物的干扰，减少对实验对象的不必要的照射，放射性示踪剂的放射化学纯度应95%。,2018/9/23,18,（5）放射比活度,由于示踪实验时，示踪剂被稀释，故原始的比活度应足够高，才能满足测量要求。 原始比活度的可根据下式计算：ACE/D2BA：原始比活度C：原始放射性示踪剂用量E：仪器的探测效率D：稀释倍数B：仪器的本底,2018/9/23,19,例：静脉注射示踪剂，被观察组织摄取该示踪剂的量约占总量的1%，拟10天后取样，在此期间示踪剂从该组织中消失约为摄入量的90%，取样约占该组织的10%，仪器测量效率为50%，本底为125cpm。 计算：最少放射性dpm：125250%=500dp
7、m取样时该组织的总dpm：50010%=5000dom初始时该组织的总dpm：5000（1-90%）1%=5106dpm初始引入的示踪剂用量：5106 60=83.8KBq,2018/9/23,20,2、防止实验过程中的交叉污染,实验室应按“三区”进行配置，进行放射性操作的器材不能与非放射性器材混用。 不同的标本应分开放置，防止放射性污染，导致实验结果不准确。,2018/9/23,21,3、注意安全防护,所有操作均需按放射性操作规程进行；放射性操作前应进行冷实验，以减少不必要的照射。,2018/9/23,22,4、妥善处理放射性废物,示踪实验所产生的放射性废物，应分类放置、储存，及时处理，防止
8、对环境造成污染和对人员的不必要照射。,2018/9/23,23,三、核素示踪实验的特点,灵敏度高：标记物比放高，化学量小，作超微量分析可达ngpg。 特异性强：每一种检测项目，都有专一的标记物。 方法简便、准确性好：核射线的测量受外界、pH、温度等条件影响小。 符合生理条件：体内核医学的各种检查，不干扰机体内环境，对细胞代谢无损伤。 定性、定量、定位检测和研究：除超微量分析外，与电镜结合能进行亚细胞水平的定位分析。,2018/9/23,24,第二节 放射性核素标记化合物,预习，下次课讲授,2018/9/23,25,第三节 相关核素示踪技术,一、核素稀释法 二、放射自显影术 三、物质转化示踪技术
9、 四、核酸探针标记技术 五、活化分析,（单独讲授）,2018/9/23,26,一、核素稀释法,1、基本原理根据化学物质稀释前后质量相等的原理，即已知比活度为S1、质量为m1的标记物和质量为m2的同一种化学形态的非标记物均匀混合时，标记分子被非标记物稀释，混合物的比活度S2比S1低，混合前后总放射性相等。即：S2（m1+m2）=S1m1若m2m1，则： S2m2=S1m1,2018/9/23,27,如分析对象为液体，以及稀释前后物质在深液中的浓度基本不变，则可用放射性浓度（如dpm/ml）代替放射性比活度，用稀释前后的v代替质量m，则上式可写成：C2（v1+v2）=C1v1若C2C1，则：C2v
10、2=C1v1,2018/9/23,28,2、正稀释法,用已知量的标记物为示踪剂来测定未知量的非标记物的稀释法称为核素正稀释法。 求m2（v2）,2018/9/23,29,例1：,用放射性浓度为3106cpm/ml的125I-HSA1ml注入一成人体内，待平衡后取静脉血1ml，测其放射性浓度为500cpm/ml，问该人的血容量是多少？C1= 3106cpm/ml v1=1ml C2=500cpm/ml 求v2？C2（v1+v2）=C1v1因C2C1，则：C2v2=C1v131061=500v2 v2=3106/500=6000ml,2018/9/23,30,例2：,欲测蛋白质水解液中天冬氨酸的含
11、量，将5mg比活度为17kBq/mg的标记天冬氨酸加放水解液，混匀后分离出一部分纯天冬氨酸，测得其比活度为0.37kBq/mg，求该水解液中天冬氨酸的含量。S1=17kBq/mg m1=5mg S2=0.37kBq/mg m2？S2（m1+m2）=S1m10.37（5+m2）=175m2=225mg 225-5=220mg则该水解液中天冬氨酸的含量为220mg。,2018/9/23,31,2、反稀释法,用已知量的非标记物测定样品中标记物含量的稀释方法。因标记特的量极微，或混有其他放射性杂质，直接测量无法准确获得标记物的量，故加入已知的非标记物混匀后，测得放射性，运用公式：S2（m1+m2）=S
12、1m1或C2（v1+v2）=C1v1，此时S1、S2、m2（C1、C2、v2）已知，求的是m1（v1）。,2018/9/23,32,3、核素稀释法的优点,最大优点：不需待测物质定量回收。尤其是以下情况（1）未知物质无法定量分离；（2）需要快速分析；（3）需分离的物质浓度很低；（4）测量整体分布容积。,2018/9/23,33,三、物质转化示踪技术,示踪剂可以与被示踪特一样参与机体内的运行、分布并参与机体的各种转化、代谢过程。 运用各种标记物前体，来判断前体与产物之间的关系，如转化速度、转化部位、转化所需条件、转化过程、转化影响因素等。,2018/9/23,34,1、掺入实验,*A,时间,P,测
13、量,有放射性,无放射性,A是P的前体,A不是P的前体,*A,P,B,放射性依次出现,A先转化成B，再由B转化为P,2018/9/23,35,（1）主要技术参数,1）掺入百分率（相对参入量）掺入百分率=产物放射性/前身物放射性100%2）相对比活度相对比活度=产物的比活度/前身物的比活度,2018/9/23,36,（2）应用举例,3H-TdR 掺入,3H-TdR,DNA,淋巴细胞转化实验,机体免疫功能,其他增殖细胞实验,细胞周期,细胞增殖,肿瘤细胞实验,LAK细胞活性,NK细胞活性,肿瘤免疫,+化疗药物,肿瘤药敏,2018/9/23,37,2、微生物放射性测量,14C-葡萄糖,细菌,14CO2,
14、细菌快速诊断,抗生素,细菌药敏,6h出报告,14C-尿素,口服,HP,14CO2,诊断胃HP感染,2h出报告,2018/9/23,38,3、其他,（1）物质吸收部位实验（45Ca吸收示踪实验） （2）物质在不同组织转运实验（Ca在血浆与骨之间的交换；动脉脉粥样硬化斑块中胆固醇来源等。） （3）生物膜两侧物质的转运（孕妇与胎儿通过胎盘进行物质转运；细胞膜内外物质的转运等。） （4）物质分布部位的研究,2018/9/23,39,四、核酸探针标记技术,在分子生物学中，放射性核素示踪技术起到了十分重要的作用。当前，核酸序列分析和核酸分子杂交中最常用的示踪手段是放射性核素示踪技术。尽管其他的非放射性示踪
15、技术进展迅速，但核素示踪技术仍是其金标准，具有不可替代性。,2018/9/23,40,核酸探针,核酸探针，一般指能与特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段发生特异性互补结合的核苷酸片段，可用于检测待测物中的核苷酸序列或基因序列。 实验应用的探针必须使DNA或RNA分子上带有可被探测的信号，最常用的是放射性核素。,2018/9/23,41,1、核酸探针的分类,（1）基因组DNA探针 （2）cDNA探针 （3）RNA探针 （4）寡核苷酸探针,2018/9/23,42,2、核酸探针的标记,（1）DNA全链标记 （2）DNA末端标记 （3）RNA全链标记,2018/9/23,43,（1）DN
16、A全链标记,1）缺口平移法（用于标记双链DNA）,3 5,5 3,DNA酶I Mg+,双链DNA,带切口的DNA,DNA聚合酶I -32P-dNTP,32P标记的单链DNA片段,2018/9/23,44,2）标记cDNAA、单链DNA探针的标记B、随机引物DNA标记C、RNA互补的cDNA标记,2018/9/23,45,（2）DNA末端标记,A、5末端标记法T4多核苷酸激酶、-32P-ATPB、3末端标记法Klenow酶、-32P-dNTP,2018/9/23,46,（3）RNA的全链标记,利用SP6RNA聚合酶，转录插入多克隆位点的外源DNA。加入-32P-UTP即可制备高比活的的RNA,2018/9/23,47,五、活化分析,利用粒子束照射样品，使其中待测稳定性核素发生核反应，变为放射性核素，从而对样品中的元素作定性和定量的超微量分析方法。包括活化和分析两步骤。,
