2012研荧光光谱法

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1、Molecular luminescence analysis,第五章 分子发光分析法,分子荧光光谱法（MFS）,5.1 分子荧光分析法,5.1.1 原理 5.1.2 荧光（磷光）光谱仪 5.1.3 分子荧光分析法及其应用 5.1.4 荧光分析新技术简介,1.概述,荧光光谱的范围可以从X光到红外光谱区。,分子荧光分析法,分子荧光分析法,1.概述 某些物质受紫外光照射后能发射比吸收的紫外光波长更长的紫外光荧光或可见荧光。,一种物质能否发射荧光，取决于它的分子结 构和它所处的环境条件。,1.概 述,分子结构：分子中有共轭结构，具有吸收辐射能，产生电子跃迁的性质。 环境条件：适当的辐射能照射，合适的

2、温 度、溶剂、酸碱度等。,基本概念,光致发光：当物质受到光照射时，吸收了某种波长的光之后，会发射出比所吸收光的波长更长的光。,分子荧光分析法：根据物质的荧光光谱特征峰位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。,电致发光：以电能来激发而发光原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光分析法,5.1 分子荧光和磷光分析,5.1.1 原理,1. 荧光和磷光的产生,具有不饱和基团的基态分子受光照后，价电子跃迁产生荧光和磷光。,5.1 分子荧光和磷光分析,激发态 第一激发态最低振动能级基 态,s = 1/2（自旋量子数） M = 2s+1（电子能态多重

3、性）,、n 电子,S0,S1,分子的激发态,单重态（S）： 当处于基态分子的电子都配对时，s = 0， 多重性 M=1，这样的电子能态称为单重态。,单重电子激发态（S1 ，S2）：当基态的某个电子吸收光能之后，被激发到某一激发态上。如果它的自旋方向不变，s=0，M=1，这时的激发态叫单重电子激发态。,分子的激发态,图示：,单重电子 激发态,基态,E,分子的激发态,三重电子激发态（T）：在某些情况下，电子在跃迁过程中还伴随有自旋方向的改变，使两个电子自旋方向相同而不配对，这时s=1，M=3，这种电子激发态称三重电子激发态（三重态）。,基态分子中电子吸收辐射能后，只能跃迁到单重激发态各不同能级，不

4、能直接跃迁到激发三重态，因此三重态能级比相应单重态能级略低。,分子的激发态,三重电子 激发态,单重电子激发态,基态,体系跨越,吸收辐射能（ E ）,荧光的产生（去活化过程）,基态分子,紫外光照射（激发光），吸收两个能级之差的能量（E）,跃迁至单重电子激发态的多个能级,由于分子之间的振动与撞击， 能量降至第一激发态最低振动能级。,无辐射跃迁（能量以热的形式释放）,去活过程及荧光的产生,激发态较高能级激发态较高能级激发态最低能级基态各能级,（无辐射跃迁）,能量以光量子形式释放,产生荧光,去活化过程,处于激发态各不同振动能级的电子无辐射跃迁 去活化过程激发态最低振动能级,基态,（荧光）,磷光的产生,

5、单重电子激发态分子,三重电子激发态不同能级,体系跨越（无辐射跃迁）,三重电子激发态最低振动能级,振动驰豫（无辐射跃迁）,降至基态各能级,光辐射，产生磷光,荧光和磷光的区别,荧光,磷光,产生,S1* 最低振动能 级 基态,T1*最低振动能级基态,波长,较短,较长,几率,较大,较小,2. 激发光谱和发射光谱（特征光谱）,激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长照射下物质所发射的荧光强度（F），以F做纵坐标，激发光波长做横坐标作图。激发光谱反映了激发光波长与荧光强度之间的关系。,吸收光谱,激发光谱,2. 激发光谱和发射光谱,发射光谱：固定激发光波长，让物质发射的荧 光通过单色器，测定不同波

6、长的荧光强度，以 荧光强度F做纵坐标，荧光波长做横坐标作图。 发射光谱反映了在所发射的荧光中各种波长组分 的相对强度。,发射光谱,荧光（发射）光谱的特征,（1）stokes位移 荧光发射波长总是大于激发光波长的现象。 （2）荧光光谱的形状与激发光波长无关，不同波长激发光只对荧光强度有影响。,关于激发光的波长的问题,能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具有唯一性； 在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同，但荧光强度不同。 在进行荧光测定时，须选择合适激发光波长以保证荧光强度最大。,荧光（发射）光谱的特性,（3）镜像规则 荧光光谱与激发光谱呈镜像对称。（注意更正P91

7、图5.3标注！）,由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，所以激发光谱与荧光光谱的各峰之间会以某一跃迁峰为中心基本对称。,3. 荧光和分子结构的关系,发射荧光的物质应同时具备以下两个条件：物质分子必须具有强的紫外-可见吸收； 物质分子必须有较大的荧光量子产率。,3. 荧光和分子结构的关系,荧光量子产率（ f ）=,发射荧光量子数,吸收激发光量子数,f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，f越大，荧光越强，在01之间（有应用价值的荧光物质f 在0.11之间）。,= If/Ia,3. 荧光和物质分子结构的关系,（1）跃迁类型 * 较* n跃迁的荧光效率高。,（2）共轭结构凡

8、是能提高电子共轭度的结构，都会 增加荧光强度，并使荧光光谱长移。,3. 荧光和分子结构的关系,（3）刚性平面：分子的刚性越强及共平面性越好，荧光量子产率就越大。,3. 荧光和分子结构的关系,（4）取代基效应：在芳香化合物的芳香环上，进行不同基团的取代，对该化合物的荧光强度和荧光光谱都会产生影响。 增强荧光的取代基：-OH、-OCH3、-NH2、 -NHR、 -NR2等给电子基团（增加电子共轭程度）； 减弱荧光的取代基：-COOH 、-NO2 、-F 、 -Cl -NO、-SH 等吸电子基团（减弱电子共轭程度）。 对荧光影响不明显的： -R、SO3H、NH3+ （对电子共轭体系作用较小）,4.

9、影响荧光强度的（外部）因素（P93）,(1) 溶剂,一般溶剂效应,特殊溶剂效应,荧光强度随溶剂粘度降低而减弱,4. 影响荧光强度的（外部）因素,(2) 温度低温下测定，提高灵敏度温度升高 分子间碰撞增加 分子内能转化加速 荧光强度降低温度下降 介质粘度增加 分子间碰撞减少 荧光强度增强,4. 影响荧光强度的（外部）因素,(3) pH值的影响当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液pH值对该物质荧光强度有较大影响。,pH1有荧光,pH13无荧光,例：苯酚,离子化后，荧光消失,每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH范围。,4. 影响荧光强度的（外部）因素,(4) 内滤光作

10、用和自吸收现象,内滤光作用：溶液中若存在能吸收激发光或荧光体所发射荧光的物质，会使荧光减弱的现象。,自吸收现象：荧光物质的荧光发射光谱短波长一端与该物质的激发光谱的长波长一端有重叠，在溶液浓度较大时，一部分荧光被自身吸收。,F,4. 影响荧光强度的（外部）因素,瑞利散射光（Rayleigh Scattering light）：光子和物质分子碰撞时，未发生能量的 交换，仅光子运动方向发生改变。,(5) 散射光的影响：应注意Raman光的干扰,拉曼散射光（Raman Scattering light）：在光子运动方向发生改变的同时，光子将部分能量转给物质分子，或从物质分子得到能量，物质分子的能量会

11、发生改变。,散射光的影响,拉曼散射光的波长接近荧光波长，在测定时，荧光光谱会与这一散射光有部分重叠，干扰较大。可通过选用适当激发光波长的方法予以消除。,5. 溶液荧光的猝灭（熄灭） (P95),荧光猝灭剂的影响荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。 引起荧光猝灭的物质称荧光猝灭剂,常见荧光猝灭类型,（1）碰撞猝灭：猝灭剂分子与处于激发态的荧光物质分子碰撞而损失能量。 （2）静态猝灭：部分荧光分子与熄灭剂分子作用生成了非荧光的配合物。 （3）转入三重态的猝灭：在荧光物质分子中有溶解氧的存在或引入溴或碘后，易发生体系跨越而转变成三重态。,常见荧光猝灭类型,

12、（4）荧光物质的自猝灭：单重激发态分子和未激发的荧光物质分子碰撞引起自猝灭。荧光物质浓度超过 1g/L 时，会产生自身猝灭。,注意：荧光猝灭剂在荧光分析中会产生测定误差。但是，如果一个荧光物质在加入某种猝灭剂后，荧光强度的减弱和荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可利用这一性质测荧光猝灭剂的含量 荧光猝灭法。,6.荧光强度与溶液浓度的关系（P93）,If = f Ia （1）,I0,It,If,Ia,c , l,6.荧光强度与溶液浓度的关系,If =f Ia ，Ia = I0 - ItIt / I0 = 10-A = 10-lc It = I0 10-lc Ia = I0 - I0 10-lc = I

13、0（1- 10-lc ）,6.荧光强度与溶液浓度的关系,Ia = I0（1 - e - 2.303lc ）（l c0.05） e - 2.303lc = 1 - 2.303lc，Ia = I0 2.303l c,If =f Ia,6.荧光强度与溶液浓度的关系, If =f Ia = 2.303f I0l c当f、I0、l 固定不变时，If 与c成正比 If = K c （l c0.05）（2）,7. 定量分析方法,标准曲线法定量分析依据： If = K c以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓 度为横坐标绘制标准曲线。,7. 定量分析方法,标准对照法 如果试样数量不多，可用比较法进行测量。 配一标准溶

14、液浓度为Cs， Cs与未知液浓度Cx相近， 并在相同条件下测定它们的荧光强度。Fs Fs0 = k cs （1）Fx Fx0= k cx （2）cx = cs （ Fx Fx0 ）/ （Fs Fs0）,5.1.2 荧光光谱仪,光源,狭缝,激发光单色器,狭缝,样本,表面吸收物质,发射光单色器,检测器,放大器,指示器,记录器,荧光光谱仪主要部件,激发光源要求：发光强度大，适用波长范围宽。常用：高压氙灯、高压汞灯、激光光源。 单色器在荧光分光光度计中，采用光栅做单色器， 当样品中有杂质荧光或散射光干扰，可采用适当的滤光片将其滤除。,荧光光谱仪主要部件,检测器：光电管或光电倍增管。 样品池石英样品池,

15、荧光分析法的特点（P97）,1.灵敏度高（提高激发光强度，可提高荧光 强度），达 ng/ml ； 2.选择性强（比较容易排除其它物质的干扰）； 3.试样量少，方法简便； 4.提供比较多的物理参数。,5.1.3 分子荧光分析法的应用,荧光分析法与UV-Vis法的比较,相同点： 都是分子光谱，都需要吸收紫外-可 见光，产生电子能级跃迁。,荧光法与UV-Vis法的比较,不同点：,荧光法测定的是物质经紫外-可见光照 射后发射出的荧光的强度 (F)，是发射 光谱;,UV-Vis法测定的是物质对紫外-可见光的吸收程度 (A)，是吸收光谱;,荧光法定量测定的灵敏度比UV-Vis法高。,分子荧光分析法的应用,定性分析：因物质结构不同，吸收紫外光波长也不同。,定量测定：同一种物质的稀溶液，浓度大的发射的荧光较强。,1.有机化合物的分析,芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光，部分可直接用荧光法测定。（如具有致癌活性的多环芳烃荧光分析法是最主要的测定方法） 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，自身能发荧光的很少，需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。,