《生物:1.2《基因工程的基本操作程序》课件1(新人教版选修3)》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生物:1.2《基因工程的基本操作程序》课件1(新人教版选修3)(47页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在,并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,(二)、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,
2、请阅读P9第一和二两段,一、目的基因的获取,(一)从基因文库中直接获取,1.基因文库:概念见P9,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,基因组DNA文库:含有一种生物的全部基因,部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因, 如:cDNA文库,3.基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下,便于获得所需的目的基因。,4.获取目的基因的根据:,见课本P9,基因组文库与部分基因文库的关系,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,5.基因文库的构建方法之一,(1)直接分离法(鸟枪法),某种生物的单链mRN
3、A,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反(逆)转录酶,DNA聚合酶,反转录法:cDNA的合成流程图解,5.基因文库的构建方法之,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,2、利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物:,热稳定DNA聚合酶(Taq酶),模板DNA( 需含有目的基因 ),Mg2+(激活剂),条件:,缓冲溶液,一对寡核苷酸序列:与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物,前提:,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性:加热至9095双链DNA解链成为单链DNA 退火:冷却至556
4、0部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸:加热至7075以目的基因为模板,合成互补的新DNA链,2、具体过程,PCR(多聚酶链式反应), 概念:PCR全称为_,是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件:_、 _、_ 、 _.等,原理:_,方式:以_方式扩增,即_(n为扩增循 环的次数),结果:,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列(前提条件),过程:,a、DNA变性(90-95):双链DNA模板 在热作用下,_断裂,形成_,b、退火(
5、复性55-65):系统温度降低,引 物与DNA模板结合,形成局部_。,c、延伸(70-75):在Taq酶的作用下, 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1)反转录法: 以目的基因转录成的信使RNA为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需
6、的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法 :,3、人工合成的目的基因,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、目的: 所需物质:,使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,2、基因表达载体的组成:,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们各自的作用是什么?,启动子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片断,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质 终止子:位于基因的尾端的
7、一段特殊的DNA片断,能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶:既用到限制酶切割载体,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞,必需以表达载体的方式携带进去。,注意,三、将目的基因导入受体细胞,(一)转化:,(二)方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生
8、物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内,并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法: (1)农杆菌转化法 农杆菌特点:,易感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力,原理:Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞,并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程:,优点,(2)基因枪法 (3)花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞 方法:显微注射法 程序:,目的基因表达载体提纯 取卵(受精卵) 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点:繁殖快、单细胞、遗传物质
9、少 方法:,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,(一)、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 (关键步骤),.首先取出转基因生物的基因组DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针 .使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,(1)方法:,DNA分子杂交,(2)过程:,归纳步骤,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段,将两种生物的DNA分子的单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,那么,互补的碱基序列就会结合在一起
10、,形成杂合双链区;在没有互补碱基序列的部位,仍然是两条游离的单链。,P15思考与探究,(二)、鉴定(个体生物学水平),2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,归纳步骤,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂
11、交,分子杂交(注意与上不同之处),抗原抗体杂交,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测:是否插入、转录、翻译 鉴定:,练习1:(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 (1)获得耐盐基因后,构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处,DNA连接酶作用于 处。(填“a”或“b”),a,a,练习1:(2008理综山
12、东卷)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 (2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。 (3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术,该技术的核心是 和 。 (4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功,既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测,又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法(花粉管通道法),植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,1)以下说法正确的是 ( ) A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的
13、运载体 C、运载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2)不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 ( ) B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3)有关基因工程的叙述中,错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4)有关基因工程的叙述正确的是 ( ) A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D
14、、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 ( ) A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,知识点一:1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子:位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子,基因就不能转录。 终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,它能阻碍RNA聚合酶的移动,并使其从DNA模板链上脱离下
15、来,使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),不能转录为信使RNA,不能 编码蛋白质。,:能转录相应的信使RNA,能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列,在该序列中, 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子:,外显子:,知识点一:2.真核细胞的基因结构,