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1、第三章蛋白质定位的方法,第二节细胞器分离结合免疫印迹法定位蛋白,本节课的主要内容,蛋白质的定位 细胞器的分离 免疫印迹法 具体的实验实例,蛋白质定位,无论原核还是真核细胞都有一个高度有序的结构，新生的蛋白质都要被准确的运送到细胞的各个部分，如溶酶体、线粒体、叶绿体、细胞质和细胞核等，以更新其结构组成和维持其功能，这一过程称为蛋白质的定位。 真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。 真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或糙面内质网合成，最终运至不同地点，形成成熟的蛋白质并行使功能。 细胞根据蛋白质是否携带分选信号以及分选信号的特征，选择性地将各种蛋白
2、质送到细胞不同部位。根据蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。 细胞内蛋白质的分选和运输对于维持细胞的正常结构与功能、完成各种生命活动非常重要，在许多情况下，蛋白质的异常转位与细胞的病例变化密切相关。,蛋白质定位,蛋白质的亚细胞定位常用方法：差速离心、密度梯度离心法；免疫胶体金标记；免疫荧光；免疫印迹法；与GFP构建融合基因表达融合蛋白；,细胞器的分离技术,离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在同一离心场内的沉降
3、速度不同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器,差速离心：,采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。,大颗粒首先沉到管底,较小颗粒沉降,细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。,密度梯度离心法：,预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油），利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。,注：待分离颗粒密度比介质密度都要大：不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部,差速离心法,其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角
4、式转子。 缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。,密度梯度离心法,该法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。,部分细胞器的分离方法,一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。 1.细胞膜的分离细胞膜又称质膜，分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说
5、，红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可，其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同，采用梯度离心后，分布于指定区域，可分离得到纯制品2.线粒体的分离线粒体普遍存在于真核细胞中，它是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能，线粒体的分离主要靠差速分离。3.线粒体膜分离线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心4.聚核糖体的分离核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖体。5.微粒体分离微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核糖核酸，蛋白
6、质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。,免疫印迹法和差速离心法研究蛋白质定位,免疫印迹法（immunoblotting test,IBT),也被称为蛋白质印迹法（Western blotting)。对已知蛋白质的表达，可用一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过构建融合蛋白，对所带标签的抗体进行检测。差速离心法是交替使用低速和高速进行离心，用不同强度离心力使不同质量的物质分级分离的方法，尤其适用于混合样品中沉降系数差别较大组分的分离。差速离心法结合蛋白质印迹法，可观察到蛋白质在各亚细胞结构中的分布，这也是目前比较常用的、比较准确的蛋白质定位研究方法
7、。,蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析,Western Blot简介Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析,Western Blot 简介：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白
8、质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,Western Blot 基本原理,蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。,Western Blot 优点,高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western Blot 流程,蛋白样品的制备 SDS-PAGE 转
9、膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！ 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进行抽提。 一般实际用的比较多的是 RIPA裂解液，样品提取以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，然后取出部分蛋白定量，其余加入上样缓冲液 100充分变性，再分装保存于-20 。,蛋白样品的提取,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定
10、样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。 蛋白质浓度测定的各种方法汇总： http:/ 按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量2050g。,蛋白样品的变性,一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位） ，因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构， 蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading
11、buffer），并于 95-100C 煮沸 5 分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于 70C 加热 5-10 分钟，标准的上样buffer 称为2X Laemmli buffer，上样时与样本1：1混合后变性上样即可,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带
12、负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,【SDS-PAGE基本原理】,蛋白质-SDS胶束的特点：,（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒 （2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS
13、 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶浓度与蛋白分离范围,SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：http:/ Tris-甘氨酸系统。,灌制分离胶 隔绝空气,ddH2O 0.1%SDS:8%,灌制积层胶 插入梳子,转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，N
14、C）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍： http:/ 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一抗、二抗孵育,把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用PBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床
15、上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收一抗溶液，用PBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用PBS漂洗膜2次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP),Western Blot结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）http:/ Readings,生物秀Western Blotting专题 http:/ Millipore的蛋白印迹手册 http:/ Bio-Rad的western Blotting操作手册 http:/ Western blot问题解答专帖 http:/
