酶的非水相催化ctgu

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1、Chapter 6 Enzymatic catalysis in Non-aqueous system,酶的非水相催化 教学目标：掌握非水相中酶的催化特性及反应条件的选 择与控制方法。 教学要求：了解酶催化反应的介质及其特点；理解有机介质 中水和有机溶剂对酶催化反应的影响；掌握非水相中酶 的催化特性及反应条件的选择与控制方法。 重点：非水相中酶的催化特性及反应条件的选择与控制。 难点：有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响。,Contents of chapter 6,1、酶催化反应的介质,2、有机介质反应体系,3、酶在有机介质中的催化特性,4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制,Go,Go

2、,Go,Go,5、酶非水相催化的应用,Go,6.1 酶催化反应的介质,水是酶促反应最常用的反应介质,但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。,由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。,是否存在非水介质能保证酶催化？,在活细胞中酶大多集中在水和有机溶剂的界面，酶在细胞中的作用模型是含水有机溶剂系统的酶促反应。,Hill.A.C(1898)J.Chem.Soc,73,634-658 Kastlc,J.C.and LocvCnhart,A.a.(1900)Am Chem,J,24,491-525 Sym,E,A(1

3、933)Biochem,Z,258,304-324 Sym,E,A(1936)Enzymologia 1,156-160,失败的原因？,酶催化反应的介质,Klibanov 的实验,酶催化反应的介质,Zaks,A. and Klibanov,A.M(1984),Science224,1249-1251 ZaKs,A. and Klibanov,A.M.(1985),Proc.Natl,Acad,Sci. u.s.a. 82,3192-3196.,成功的 原因？,酶非水相催化的类型,有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物两者或其中之一为

4、疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。气相介质中的酶催化酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。,酶非水相催化的类型,超临界介质中的酶催化酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。 离子液介质中的酶催化酶在离子液中进行的催化作用。离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性

5、低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。,6.2 有机介质反应体系,非极性有机溶剂酶悬浮体系(微水介质体系)用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在 有机相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性 (含水量一般小于2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸 附在固体载体表面上。 与水互溶的有机溶剂水单相体系有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产 物都能溶解在这种体系中。 非极性有机溶剂水两相/多相体系由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶 性)相所组成的两相体系。,（正）胶束体系：胶束又称为

6、正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。 表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。 反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界面中进行。 反胶束体系：又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。 表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。 反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行。,不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂

7、和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。,一、反应体系中水对酶催化反应的影响,天然酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。 酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。 有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量。,必需水,猪胰脂肪催化甘油三丁

8、酸酯和正庚醇的转酯反应,1、必需水概念,紧紧吸附在酶 分子表面，维 持酶催化活性 所必需的最少 水量，称为必 需水。,干燥酶的水合过程, 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g水/g酶； 与酶分子表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g)； 凝聚到酶分子表面相互作用较弱的部位（0.25-0.38g/g）； 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。,2、酶活与水的关系：,酶活最大时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性（柔性）之间达到最佳平衡点。 “刚柔并济”,3、影响酶必需水含量的因素（酶和溶剂）,a不同酶需水量不同 溶菌酶在含水量38%以上，即每个酶分子周围有300 个以上水分子，整个酶

9、被一层单分子水层所包围，酶活性才能发挥。 在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附50个水分子 脂肪酶仅需几个水分子就可显示出活性。 b.同一种酶在不同有机溶剂中最适反应需水量不同 溶剂疏水性越强，需水量越少。,4表征必需水作用的参数-热力学水活度,水活度（water activity)：特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数 Xw与水活度系数w的乘积： w =w Xw w是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大，w越大。 w 是一个强质性质的物理量，在平衡状态时，反应体系中各组分（酶、溶剂、底物和产物）的w 是相同的。,研究水活度的意义,1、最佳水活度与溶剂的极性几乎无关，大约在0.55左右。 2、可

10、以排除溶剂对最适含水量的影响。 3、水活度可由反应体系中水的蒸汽压除以在相同条件下纯水的蒸汽压而测得。,二、有机溶剂对酶催化反应的影响,常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，丙醇，乙腈，二氯甲烷等。 1、有机溶剂对酶结构与功能的影响 在有机溶剂中，酶分子（经过修饰后可溶于有机溶剂者除外）不能直接溶解，而是悬浮在溶剂中进行催化反应。根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持其空间结构完整性的情况也有所差别。 酶在有机介质中与有机溶剂接触，酶分子的表面结构将有所变化。 当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分溶剂能渗入到酶分子的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合能力；可能与底物竞争活

11、性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。,2、有机溶剂对酶活性的影响 极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶的变性失活。因此应选择极性适宜的溶剂，控制好介质中的含水量，避免酶在有机介质中因脱水作用而影响其催化活性。 有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明其极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。 研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子结合水，对酶活力的影响就越大。极性系数lg P 2的极性溶剂一般不适宜作为有机介质酶催化的溶剂使

12、用。,（1）单相共溶剂体系中，有机溶剂对酶活性影响 有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象的氢键和疏水作用力，或破坏酶周围水化层，使酶失活或变性。 有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度（最适浓度）达到最大值；若浓度再升高，则活性下降。 （2）低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保存，但也有某些酶活性亦变化。,（3）反向微团体系中，微团效应使某些酶活性增加 酶活力依赖微团的水化程度，即取决于水与表面活性剂的摩尔比（R）。 超活性：凡是高于水溶液中所得酶活性值的活性称为超活性（Super-activity）。 认为：超活性是由围绕在酶分子外面的表面活性剂这一外壳之较大刚性所引

13、起。,超活性产生机理,根 据,（1）微团水化程度（W）（W=H2O/表面活性剂）的最佳值和酶活性的最大值呈正相关。 （）W值最佳时，微团内径总是相当于被包裹的酶分子直径。,3、有机溶剂对底物和产物分配的影响有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分配，从而影响酶的催化反应。 有机容剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。 一般选用2lg P5的有机溶剂作为有机介质为宜。,6.3 酶在有机介质中的催化特性,酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。,在有机

14、介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。 不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的有机介质中，酶的底物专一性也不一样。在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底物容易反应；而在极性较弱的有机溶剂中，疏水性较弱的底物容易反应。,1、底物专一性,2、对映体选择性（enantioselectivity） 又称为立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标。 酶在有机介质中催化，与在水溶液中催化比较，由于介质的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。 酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强

15、的有机介质中，酶的立体选择性较差。,3、区域选择性 酶在有机介质中进行的催化反应具有区域选择性（regioselectivity）, 即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。 4、键选择性：酶在有机介质中进行的催化反应具有化学键选择性。键选择性与酶的来源和有机介质的种类有关。,5、稳定性,热稳定性提高；储存稳定性提高,例：丹麦Nove公司生产的脂肪酶Lipozyme TM，在水溶液中60保温1小时后剩余的酶活只有10%，而在橄榄油中同样条件下脂肪酶的剩余酶活仍近100%。 60对乌桕脂和硬脂酸甲酯的转化反应24小时后，酶仍保持82%。,在低水有机溶剂体系中，酶的稳定性与含水量密切相关

16、； 一般在低于临界含水量范围内，酶很稳定；含水量超出临界 含水量后酶稳定性随含水量的增加而急剧下降。,6、pH值特性在有机介质反应中，酶所处的pH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所使用的缓冲液 pH 值相同。这种现象称之为pH印记（pH-imprinting）或称为pH记忆。 酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH 值接近或者相同。利用酶的这种pH印记特性，可以通过控制缓冲液中pH值的方法，达到控制有机介质中酶催化反应的最适pH值。,有机相酶反应的优点,1有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进行的反应。 2可提高酶的热稳定性。 3可改变反应平衡移动方向。 4. 可控制底物专一性。 5. 酶和产物易于回收。 6. 可避免微生物污染。,6.4 有机介质中酶催化反应的条件及其控制,酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、裂合反应等。 酶在有机介质中的各种催化反应受到各种因素的影响：酶的种类和浓度、底物的种类和浓度、有机溶剂的种类，水含量、温度、pH和离子强度等。,