新分子生物学课件2012-5

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1、五、常用的PCR改进技术（PCR应用）,（一）RT-PCR (reverse transcription PCR) RT-PCR是一种快速、简便、敏感性极高的检测 RNA的方法。 其基本原理是在逆转录酶催化下，以mRNA为模板合成互补DNA（cDNA），再以此cDNA为模板进行PCR 反应，使低丰度的mRNA得以扩增放大，便于检测。 该方法的关键步骤是RNA的逆转录，因此要求RNA模板必须完整。常用的逆转录酶有：鸟类成髓细胞白血病毒（AMV）的逆转录酶和莫洛尼鼠白血病毒的逆转录酶。,图7-13 RT-PCR原理和过程示意图,（二）定量RT-PCR,通过设立RNA竞争性参考标准和利用PCR技术来

2、定量分析基因表达的一种最快速、敏感的方法。 它与RT-PCR的区别：设立了RNA竞争性参考标准（RNA-CRS）。 1、内源性基因模板标准的选择与应用。 （1）选择选择那些在组织中普遍表达，且表达量比较恒定的一类mRNA作为内源性基因模板标准。编码这些mRNA的基因都是一些保守性强的管家基因，如-肌动蛋白等基因。,（2）应用： 将这些表达量恒定的mRN稀释成不同浓度，分别与样本中的目的mRNA混合后，在各自不同的引物引导下共同逆转录，共同进行PCR扩增。 将待测模板的扩增产物与内标准的扩增产物比较，当两者产物量相等时，待测mRNA量即与内标准mRNA相应的稀释浓度相同，从而达到定量的目的。 由

3、于引物不同和mRNA的序列差异，扩增效率有一定差异，经过成百万倍放大以后差异就更大了，因此选择这类mRNA作为内标时，只能对目的mRNA进行相对定量分析。,2、体外构建RNA-CRS,（1）参考标准构建 为了对目的mRNA进行精确定量，人们在体外构建了多种RNA-CRS。这些人为的RNA-CRS与目的mRNA在序列、大小和二级结构上相同或高度相似，可对目的mRNA进行精确定量分析。 以重组人SCF（stem cell factor）为例，构建RNA竞争性参考标准（图7-14）。,（2）应用 用SCF RNA-CRS对人重组SCF（干细胞因子）进行了定量TR-PCR分析。 将SCF RNA-CR

4、S稀释成不同浓度； 分别与等量待测总RNA混合； 在相同条件下，用相同引物进行逆转录，形成cDNA； 用PCR技术对cDNA进行共同扩增（用荧光定量PCR仪和被荧光素标记的dNTP） 用软件分析DNA片段的荧光信号强度/每次扩增。 绘制PCR动力学曲线，确定达到平台期的循环次数（假如为22次达到平台期）,选择指数扩增期进行QRT-PCR（20次）； 分析PCR结果： a、测定靶基因荧光信号和内标准荧光信号强度；以lg（校正内标准荧光信号/靶基因荧光信号）为纵坐标，其中校正内标准荧光信号=（靶基因长度/内标准长度）内标准荧光信号 以lgRNA-CRS拷贝数为横坐标（浓度） b、建立直线回归方程。

5、 c、绘制回归直线：回归直线与横轴的交点表示内标准和靶基因分子数之比为11。 即, 最初的靶基因分子数等于内标准分子数。,（三）实时荧光定量RT-PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）,1原理 （1）荧光染料（fluorescent dye, fluorochrome） 荧光基团通常有自己的单一光吸收峰，即能吸收某一特殊波长的光。荧光基团吸收激发光的能量后通常以三种方式释放出能量： 光能； 热能； 转移给邻近的分子。 （2）荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 当

6、某个荧光基团的发射光谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移。相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽（淬灭）。,（3）PCR扩增及其监测 荧光PCR独特之处是：在PCR过程中，能利用荧光染料释放的荧光信号变化直接反映PCR扩增产物数量的变化。由于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，通过自动化仪器对荧光进行采集和分析，能够实现对PCR过程的实时监测，达到对原始模板定量分析的目的。 主要采用以下几种模式： 仿溴乙锭着色检测, 荧光标记引物 , 荧光标记探针 : PCR体系中除常规扩增引

7、物外，还需要针对扩增模板的特异性探针，探针结合的位置在引物对的中间。,A. 水解探针模式（hydrolysis probe）,采用双荧光标记探针（TaqmanTM 5-nuclease assay），利用Taq DNA聚合酶的53聚合酶活性及53外切酶活性，在链的延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断， 使5端标记的TAMRA（荧光报告基团）和3端标记的FAM（荧光淬灭基团）分开，产生红色荧光。由于荧光信号变量与扩增产物变量成正比，可根据PCR反应液连续变化的的荧光强度，绘制反应曲线，计算出初始模板数量。（图7-15）。,（四）反向PCR（inverse PCR）,反向PCR对已知DNA片

8、段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。 原理：见图7-17。,（五）Alu-PCR,Alu序列是哺乳动物基因组中特有的重复序列，拷贝数高达90万，散布于基因组DNA中。 利用Alu序列中高度保守的序列设计引物，扩增两个Alu序列之间的未知DNA序列的方法Alu-PCR。见图7-18。,（六）原位PCR(in-situ PCR),原位PCR直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含相应特异序列的细胞的一种方法。 其关键步骤是制备细胞： 细胞固定：通常用1%4%的聚甲醛固定细胞，蛋白酶K彻底消化蛋白质 。,（七）巢式PCR（N-PCR）,设

9、计两对引物：外引物对和内引物对。外引物的互补序列在模板的外侧，因此，外引物结合于模板的外侧，而内引物的互补序列在模板的内侧，所以，内引物结合于模板的内侧（见图）。该方法能提高检测灵敏度和特异性,（八）不对称PCR（asymmetric PCR）,不对称PCR是一端使用高浓度引物，另一端使用低浓度引物，用以扩增单链DNA的方法。 目的：扩增产生单链DNA。原理： 反应中采用两种不同浓度（1：50）的引物进行不对称扩增。其原理见图9-10,（九）固相锚定PCR（solid-anchored PCR）,固相锚定PCR利用固相基质上的特异性寡核苷酸链作为引物合成cDNA，使合成的cDNA与固相基质以共

10、价键相连。 如用寡聚dT为引物合成的附着于固相基质上的cDNA包含了一个cDNA文库相似的序列信息，这种cDNA文库固相文库。 由于结合在固相基质上的cDNA可作PCR模板，将固相基质放入PCR反应混合液中即可扩增cDNA 。用途很广。,（十）长片段PCR（long distance PCR）,用PCR技术扩增很长的DNA序列（超过5 kb的长片段）时，可用2种DNA聚合酶进行扩增，第一种DNA聚合酶含量多，无35外切酶活性，第二种酶含量少，有35外切酶活性。在PCR扩增过程中，当第一种酶掺入一个错误dNTP，这时，第二个酶则切除错误碱基，使DNA合成继续下去。 还可通过增加延伸时间，如10-

11、20分钟，来合成长DNA片段。 也可以应用续段PCR技术来扩增长DNA片段。,（十一）多重PCR(multiple PCR),多重PCR在一次反应中加入多种引物，同时扩增一份DNA样品中的不同DNA序列。 使用该方法的前提是，各对引物扩增的DNA片段长度要有差别，否则不能用电泳区分。,第四节 基因芯片和微阵列技术,基因芯片在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面，通过与标记的样品杂交和杂交信号检测分析，以得到大量样品（30 000到60 000个基因）信号的DNA检测装置，又称为生物集成芯片，DNA芯片，DNA微阵列，寡核苷酸微芯片。 它的突出特

12、点在于高度并行性，多样性，微型化和自动化。它一出现，就显示出强大的生命力，其发展速度令人瞩目，应用前景令人鼓舞。,一、DNA芯片的制造技术,DNA芯片制造可分为两大类、四种方法，下面介绍光引导原位合成法： 1、在玻璃芯片上埋植一片林立的具有衔接作用的分子。 2、在这些衔接分子上合成DNA探针： DNA探针合成 目前采用屏蔽掩模系统和光敏覆盖物来制造。 根据探针上预定碱基的种类，如需要A碱基，让屏蔽掩模系统在打开那些需要A碱基的探针纤丝的同时，将其他不需要A碱基的探针纤丝遮掩保护起来。,再通过闪光将这些暴露出来的探针纤丝上的光敏覆盖物去除，然后将芯片浸入含有A碱基的溶液中，需要A碱基的探针纤丝上

13、就增加一个A碱基。 将添加了A碱基的探针马上用光敏物质重新覆盖起来，同时根据碱基需要（如C）更换新的屏蔽掩模。这个屏蔽掩模将不需要C碱基的探针钎丝遮掩起来，让需要C碱基的探针纤丝暴露出来。,然后，将芯片浸入含有C碱基的溶液中，需要C碱基的探针纤丝上就增加一个C碱基。 同样的程序也适用于T和G。 四个程序分别循环一次，所有探针纤丝都添加了一个自己需要的碱基。四个程序依次循环20次，就可以合成一个具有20个碱基的探针（目前的标准长度）。 优点可以合成密度极高的阵列；缺点是耗时、操作复杂。,二、样品的制备及其杂交检测,1、样品扩增 可采用固相PCR方法，引物特异性强，无交叉污染，并省去了液相处理的烦

14、琐；也可采用大规模并行固相克隆法，该方法可对一个样品中的数以万计的DNA片段同时进行克隆，且无需单独处理和分离每一个克隆。 2、样品标记 主要采用荧光标记法，先用荧光素Cy3、Cy5标记dNTP，再以标记的dNTP为原料，采用PCR或RT-PCR技术标记DNA样品。见图7-20。 3、用标记的样品与DNA芯片上的探针进行分子杂交。,4、杂交信号检测,常采用荧光法，其重复性较好，但灵敏度仍较低，目前正在研发质谱法、化学发光法、光导纤维法等， 以荧光法为例：采用的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术，该技术可对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析，因为样品与探针错配一个或两个碱基，荧光强度将降

15、低5-35倍，但该方法的不足之处是会产生假阳性结果，见图7-20。,5. 信号分析与解读,芯片杂交图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成。一个完整的生物芯片配套软件应包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理软件、数据提取或统计分析软件。 对所读取的数据的处理，目前已经有许多数学统计的方法用于芯片数据处理与信息提取，应用最广泛的是聚类分析（cluster analysis），此外还有主成分分析(principal component analysis)、时间系列分析(time series analysis)等，但是还没有一种“标准”的统计方法。,三、DNA芯片技术的主要应用

16、,1、用于分析基因组和发现新基因 DNA芯片技术用于基因组研究可创造第三代遗传图。 DNA芯片技术可检测高密度DNA、样品用量极少、自动化程度高而便于大量筛选新基因。 2、用于基因表达研究 DNA芯片技术可直接检测mRNA的种类及丰度，是研究基因表达的有力工具。,3、用于DNA序列分析 主要依靠短的标记寡核苷酸片段探针与靶DNA杂交，利用杂交所获得的图谱分析靶DNA序列。 4、用于基因诊断和基因药物设计 DNA芯片可用于大规模的筛查由基因突变所引起的疾病。作出正确的诊断后，就可针对病变的靶序列设计基因药物，以改变靶序列的表达情况而达到治疗该疾病的目的。 目前已有几种DNA芯片实现了商品化。,第五节 Western免疫印迹技术,Western免疫印迹的基本原理与Northern 印迹杂交和Southern印迹杂交十分相似，都是由凝胶电泳、转膜、杂交和信号显示等步骤组成。 不同之处是Western免疫印迹检测的是蛋白质，使用的凝胶是SDS聚丙烯酰胺凝胶, 所用的探针是蛋白质抗体，而不是核酸。,