二++培养基及其制备

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1、第二章 培养基及其制备,重点：培养基的原料；培养基的营养成分；发酵培养基的选择；淀粉水解糖的制备；难点：淀粉水解理论基础；生物合成的前体物质,第一节 培养基的原材料 一、培养基的营养成分及用途微生物的养料来源光 光能自养氢、硫、氨 自养菌 .能源 亚硝酸盐、亚铁盐 化能自养 碳水化合物等有机物石油天然气和石油化工产品 异养菌功能：生长、繁殖需要；,碳酸气淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等石油、正构石蜡、天然气醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；豆饼或蚕蛹水解液、味精废液 .氮源 玉米浆、酒糟水等有机氮尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮 功能：构

2、成菌体、含氮代谢物；,.碳源,磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐 .无机盐 铁、锰、钴等微量元素功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位；.特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等功能：酶的辅助部分，维持生命活动；.水分功能：生化反应均在水溶液中进行,二、培养基的类型1.依营养物质的来源分类天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） 合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等 ）半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基） 2.依培养基制成的形式分：液体培养基；固体培养基；3.依培养基主要成分和使用目的来分基础培养基完全培养基,鉴别培养基（pH

3、指示剂：不同微生物颜色）选择培养基（如加抗生素）4.根据生产工艺来分孢子培养基种子培养基发酵培养基附：培养基配方举例,肉汤培养基,1、成份：牛肉膏 5克蛋白胨 10克氯化钠 5克 2、制法： （1）于1000毫升水中，加入上述成分，混合加热溶解。 （2）用1mol氢氧化钠矫正pH7.27.6，煮沸3分钟。用滤纸滤过，补足失掉的水分。 （3）分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口塞好棉塞包装后，高压蒸气灭菌，121灭菌20分钟。 （4）灭菌后放于阴凉处，或放冷后存于冰箱中备用。,土豆葡萄糖琼脂培养基,土豆 500g 葡萄糖 20.0g 琼脂 20.0g 称取500克土豆，去皮切成丁，立即加入1000ml

4、水，充分煮沸，用棉布过滤。滤液用水定容至1000ml，再加入其它成分。高压灭菌：115，20分钟。,三、发酵培养基的选择发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理；工业上确定发酵培养基的方法：1、了解菌种的营养要求；2、了解菌种的培养条件；3、先进行小试验，摸索菌种对碳源和氮源的 利用情况。,四、原料转换及意义发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发酵产品的品种和产量与日俱增，每年都要消耗大量粮食、油料和蛋白质原料。原则：以废代

5、好（废糖蜜、农业废料等）以可再生代替不可再生（野生植物淀粉、纤维水解物）节约原料：使发酵稳定、高产,第二节 淀粉水解糖的制备,多数微生物不能直接利用淀粉 淀粉水解糖已应用于谷氨酸发酵等工业 淀粉水解后的糖液主要是葡萄糖，少量二糖、低聚糖等 提高出糖率、糖的质量,一、淀粉水解糖的制备方法 1.酸解法：以酸为催化剂，高温高压转化优点：简单、设备少、时间短缺点：设备易腐蚀、要耐高温高压，有副反应；淀粉粒小、浓度不能太高。 水解条件：第19页 2.酶解法：淀粉酶，包括液化（-淀粉酶）和糖化（糖化酶）两步水解条件：第20页,双酶水解法制葡萄糖的优点 ： （1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件

6、比较温和。 （2）酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率高。 （3）可在较高淀粉浓度下水解（40%比酸水解高一倍）。 （4）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，发酵培养基的组成可简化。 （5）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。 双酶水解法制葡萄糖的缺点：时间长（23天）、设备多、条件（适合酶水解）较多、过滤困难,3.酸酶结合法酸酶法：先将淀粉酸水解为糊精或低聚糖，再用糖化酶水解为葡萄糖。应用：玉米、小麦等谷类淀粉，坚实。酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解为葡萄糖。应用：碎米淀粉等，酸水解不均匀。,不同糖化工艺

7、所得糖化液 质量比较,醛,二、淀粉酸水解理论基础淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。在淀粉糖化过程中，这三种化学反应的关系如下：,分解,水解,1、淀粉的水解反应及其影响因素淀粉：直链（a-1，4键缩合）、支链（a-1，6键缩合），聚合度高 -淀粉酶 ：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉-1，4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精； 淀粉-1，4；1，6葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉分子的-1，4；或-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。酸的种类：盐酸硫酸磷酸酸水解主要因素

8、 酸浓度：高利于水解，但应适当水解温度：温度加速水解,2、葡萄糖的复合反应及其影响因素复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。在淀粉的酸水解过程中，水解生成的葡萄糖受酸和热的影响，葡萄糖分子之间通过糖苷键相聚合，生成二糖、三糖及其他低聚糖。影响复合反应的因素：1）淀粉浓度的影响：淀粉乳浓度高，水解所得葡萄糖浓度也高，复合反应也强。2）酸的影响：酸浓度高，复合反应强；盐酸硫酸草酸,3、葡萄糖的分解反应及其影响因素分解反应：葡萄糖5-羟甲基糠醛有机酸（乙酰丙酸、蚁酸）、色素等。影响因素：（1）浓度：表2-9、葡萄糖浓度高， 5-羟甲基糠

9、醛生成量大；（2）pH值：表2-11、pH为3时5-羟甲基糠醛生成量最小；（3）反应时间：表2-10、时间延长，5-羟甲基糠醛生成量增大；,第三节 糖蜜前处理,一、糖蜜的来源与特点 甘蔗厂、甜菜厂的副产物； 非结晶糖，可发酵，无需糖化； 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜的成分：表2-12总糖含量50%左右胶体物质约10%灰分约10%,Bx(玻利克斯，锤度)：表示溶液的比重的方法 定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。,二、糖蜜前处理的方法 处理目的： a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性， 有利于改善发酵过程中氧的传递。 b.脱色，除去有色物质，

10、色素对产品的质量有影响，对微生物的生长和代谢有影响。 c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。,处理方法： 1.加酸通风沉淀法（冷酸通风处理法） 程序：稀释加酸通气静置取上清制备糖液 2.加热加酸沉淀法（热酸通风沉淀法） 程序：稀释加酸加热、通气静置取上清制备糖液糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥发性物质。,3.添加絮凝剂澄清处理法（聚丙烯酰胺） 程序：稀释加酸加热、加絮凝剂静置取上清制备糖液 聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。 工艺过程：原溶液（稀释）-40Bx -调pH值(33.8)-絮凝、加热到

11、90- 静置 絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1小时,三、谷氨酸发酵糖蜜前处理糖蜜中生物素含量高，不适合谷氨酸发酵 1.糖蜜预处理法活性炭处理法树脂处理法 亚硝酸处理法2.添加化学药剂处理法添加青霉素法：破坏细胞壁结构添加表面活性剂：改变细胞膜的通透性 添加抗氧剂法,3.追加糖蜜法 生物素只对谷氨酸产生菌初期有作用，待菌酶系生长完全后，生物素无作用，因此，可先用无生物素的糖蜜发酵，在用不经处理的糖蜜。 4.营养缺陷型突变株法： 将生物素缺陷型转变为其他类型的缺陷型，如油酸缺陷型、组氨酸缺陷型等，生物素对它没影响。,第四节 纤维素代粮发酵,一、石油代粮发酵 20世纪中期研究较热 石油消耗加速

12、，价格上升 微生物可利用石油的各种馏分 二、纤维素代粮发酵 1、纤维素的结构 D-吡喃葡萄糖环；-1，4糖苷键；直链多糖 两相共存学说：结晶区（分子链有序、紧密）、无定形区（分子链疏松） 酶催化降解：成本高，但发展前景好,第五节 前体物质、促进剂 一、生物合成的前体物质 前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。特别是对于某些氨基酸、核苷酸和抗生素的发酵生产，添加一定量的前驱物质（前体）其作用是非常明显的。 前体物质还可避免氨基酸合成途径中的反馈抑制。,青霉素：分子量356 苯乙

13、酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量 用量：前体的用量可以按分子量衡算，具 体使用有个转化率的问题,例：发酵生产6000单位/ml的青霉素G,需要添加多少苯乙酸？ 青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38% 实际使用时的转化率在46-90%之间用法： 1）前体使用时普遍采用流加的方法 2）前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 3）前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率,氨基酸发酵的前体物质,二、发酵过程的促进剂和抑制剂所谓产物促进剂是指那些

14、非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 所谓抑制剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能抑制某种抗生素的合成。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的：1、有些促进剂本身是酶的诱导物；2、有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；3、有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,抗生素的抑制剂,第六节 培养基灭菌,重点：消毒与灭菌的区别；灭菌方法；加热灭菌的原理；影响培养基灭菌的其他因素；培养基灭菌时间计算；分批灭菌和连续灭菌比较； 难点：培养基灭

15、菌时间计算；,一、消毒与灭菌的区别： 所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢。 消毒是指消灭一切致病微生物（病原体）。 二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用 牛奶巴氏消毒法：80-95，10min 发酵培养基的灭菌:121,20min,三、灭菌方法： 1、干热灭菌：灼烧灭菌；加热方式有电热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，干热要求时间长，温度高（一般160，2hr） 1）火焰焚烧法：接种环、试管口等 2）干烤法：利用热空气灭菌用法：160,2小时 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所以温度高、时间长。,2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。 特点：温度低、

16、时间短、灭菌效果好原因：1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低；2) 蒸汽冷凝会放出潜热；3) 饱和水蒸汽穿透力强；4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,湿热灭菌优点： 1）蒸气来源易，低价无毒； 2）蒸气穿透力强灭菌彻底； 3）蒸气冷凝释放热量； 4）蒸气易输送，易调节，易管理。 湿热灭菌缺点： 1）设备费用高； 2）不能用于怕受潮的物料；,3、射线灭菌法：1）电离辐射：、射线 。 原理 ：引起水和其他物质的电离，产生游离基，破坏DNA，从而造成细胞损伤。 特点；穿透力强，无专一性，对所有生物均有杀伤作用。适用：菌种诱变。,2）非电离辐射（紫外线） 方法：在波长265-266nm处，杀菌力最强。 原理： （1）作用于DNA ，使同链DNA相邻嘧啶间形成嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光复活酶可修复） （2）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。 适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。 特点：穿透力差。,