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1、1,实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 (Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE),动物医学院动物生化教研室,2,掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； 了解血清蛋白的主要成份。,一、实验目的,3,二、实验原理,不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。,4,Bis将单体长链连成网状结构,TEMED催化AP生成硫酸自由基,1、聚丙烯酰胺凝胶生成,催化Acr聚合成长链,Acr：丙烯酰胺 Bis：甲叉双丙烯酰
2、胺 AP：过硫酸胺（催化剂） TEMED： N, N, N,N-四甲基乙二胺（加速剂）Acr、Bis决定孔径大小 AP、TEMED决定聚合速度,5,连续胶电泳采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液 和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。 优点： 制胶简单、快捷 缓冲液pH值恒定，可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀 缓冲系统组成简单，来源广泛 缺点： 分辨率不高,2、连续胶和不连续胶电泳,6,不连续胶电泳采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由 于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然后 在一定
3、浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。 优点： 分辨率高 用于复杂和特殊样品的分离,7,不连续电泳的三种物理效应 样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应 电荷效应,电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。,不连续电泳的四种不连续体系 凝胶的不连续 缓冲液成份的不连续 缓冲液pH值的不连续 电压梯度的不连续,8,三、实验步骤,封槽清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上,9,分离胶：A:C:D:E1:2:3:2（V/V） 浓缩胶：B:C:D:E2:1:5:2（V/V）A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液 B: pH6
4、.7 Tris/Hcl缓冲液 C: 30% Acr-Bis贮存液 D: 水 E: 过硫酸铵 灌装前加入TEMED，混匀,取干净玻璃管，下端封口膜封好（重要）；用注射器加分离胶至管口1-2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口2-3mm处、封水；凝固后备用。,制胶和灌胶,10,加样用微量注射器取样品液15l，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，缓慢注入。电泳 连接电极，上负下正； 浓缩胶：3mA管，分离胶：4mA管； 待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。剥胶,取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水冲洗几次。,11,染色将凝胶柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20min，然后再浸入7%醋酸溶液中 脱色。血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。,12,分离胶和浓缩胶中A,B,C,D,E各是什么组分。 分离胶和浓缩胶中缓冲液的组分，pH值异同？它们与电极缓冲液有区别？ 本实验有哪些不连续？为什么比醋酸纤维薄膜电泳分辨率高。,四、思考题,
