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1、,真菌真菌镜检染色- 乳酸棉兰酚染色,天津市第三中心医院 检验科 张健东,真菌标本的接种 培养基选择 常用染色方法 曲霉菌属镜下形态和菌落特点 病例分析,医学重要的霉菌分类,合格痰标本,含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析 超过3种细菌，按不合格标本处理。,中华检验医学杂志,2000,23(5):312,真菌标本的接种,呼吸道标本,肺泡灌洗液,无菌体液： （脑脊液、 穿刺液、骨髓、玻璃体等）,无菌体液1-5ml打入 真菌/分枝杆菌血培养瓶,三区划线 28孵箱，5天 培养基用封口膜密封好 怀疑生长缓慢菌（如组织胞浆菌），延长培养时间至30天。 怀疑真菌生长，点种,真菌培养宜
2、使用含和不含抗菌药物的两类培养基。经空气传播有高度感染性的真菌样品、含菌丝体的真菌应在生物安全柜内处理。若采用平皿培养，应封盖。,CNAS-CL42：2012,培养基选择,沙保罗培养基SDA,马铃薯培养基PDA,CHROMagar念珠菌显色培养基,菌落形态（菌落大小、形态、色素、颜色和质地） 显微镜下真菌孢子、菌丝、产孢等特征性结构进行初步判断真菌种属。 遇到疑难的丝状真菌，应请专业组内多名技术人员观看、讨论，以确定种属。 每次观察的菌落特征均需要记录、并照下显微镜下的形态特征和菌落。 参考图谱或网上咨询,真菌培养物形态学鉴定,菌落形态 观察,酵母型菌落 类酵母型菌落 丝状型菌落（正、反） 双
3、相真菌,显微镜检查,有隔或无隔 分支或不分支 有色或无色,形态学鉴定,常见显微镜检查方法,KOH压片法（直接镜检） 墨汁染色 乳酸酚棉兰染色 六胺银染色 革兰染色： 回顾性看有利于诊断,显微镜检查方法,KOH压片：皮屑、毛发、指甲、脓液、痰等标本置于载玻片上，加一滴10-20% KOH，盖上盖玻片镜检，加热30-60s，镜检先低倍后高倍（在KOH中加入刚果红1:1，更有利于真菌检测）,墨汁染色：以无菌吸管吸取处过的标本一滴置于玻片上，再加上一小滴印墨汁混合均匀，以40角盖上盖玻片(避免产生气泡)镜检（样本与墨汁等量混合）,显微镜检查方法,显微镜检查方法,乳酸酚棉兰染色：通常采用透明胶带法 利用
4、胶带先粘一定量菌丝 再粘在预先滴加乳酸酚棉兰的载玻片上 显微镜下观察孢子和菌丝的形态、特征、大小和排列等。,六胺银染色 涂片（痰需消化，无菌液体离心）甲醇固定后自然风干 过碘酸滴染10分钟，溶液用后弃去 流水冲洗（3遍） 65银溶染液1h-1.5h染色时间根据涂片的厚度所怀疑真菌的种类，通常念珠菌染色1h即可，疑为曲霉或者其他丝状真菌须适当延长染色时间（银溶液需现用现配，只用一次） 流水冲洗（3遍） 0.25%的氯化金染1到2分钟（可重复使用） 流水冲洗 3%的硫代硫酸钠染1分钟 流水冲洗 0.1%的亮绿染色30秒到1分钟目的使得到一个背景色,显微镜检查方法,菌体的包囊壁呈黑色,曲霉菌镜下形态
5、特点,菌丝体形态 曲霉菌丝有隔膜，为多细胞霉菌。 分枝 （ 45角） 有分枝足细胞 分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形。,烟曲霉菌落特点,培养特性： 生长快 45仍可生长 开始为白色 2-3日后转为蓝绿色 背面无色或黄褐色 表面粉末状,烟曲霉菌落, PDA, 25, 7d,镜下形态,分生孢子头短粗型，梗光滑，4/5小梗覆盖，倒立烧瓶状顶囊，顶囊有单层小梗 小分生孢子呈球形，绿色，有小刺,镜下形态,足细胞,顶囊,18,鉴别要点,45生长良好，菌落呈蓝绿色 顶囊呈烧瓶状，小梗为单层，与双层的土曲霉，杂色曲霉，构巢曲霉相区别 顶囊单层和双层两种瓶梗的黄曲霉和黑曲霉鉴别，蓝绿色可与绿曲霉和棒曲霉鉴
6、别,形态学观察, 黄曲霉菌落特征生长快孢子黄色表面粉末状,黑曲霉菌落特征,生长快 PDA培养基菌落初为白色继而黑色 背面无色或中央略褐色 厚绒状 气生菌丝多,镜下形态,分生孢子头疏松放射状，梗无色，小梗为单层，双层，或单双层同时生于一个顶囊，成放射状 小分生孢子呈球形或梨形，表面粗糙,镜下形态,分生孢子*400,分生孢子*1000,鉴别要点,顶囊有单层和双层瓶梗，可与烟曲霉，土曲霉以及杂色曲霉和构巢曲霉相鉴别。分生孢子梗光滑，无色至褐色，菌落初为白继而黑色，可与黄曲霉鉴别。,形态学观察,土曲霉菌落特征生长快菌落圆形孢子淡棕色或棕色,形态学观察,构巢曲霉 绿色，浅黄到黄色（正面） 紫红色到橄榄色
7、（背面） 顶囊（半球形或烧瓶状） 小梗 双层，第一层略长 孢子 (球形，粗糙，成链排列),形态学观察,杂色曲霉菌落特征 菌落生长慢 紧密、圆形 绒毛状到羊毛状 颜色数种，从青绿到红绿,曲霉菌形态特点,青霉属,培养特性 橘青霉PDA培养基上25-28生长较快，菌落表面呈绒状，少数为絮状，表面为蓝色或灰绿色，背面黄色至橙色。 绳状青霉表面白色至粉色，有时有蓝绿色 区域。 马尔尼菲青霉初为灰白色蜡样，膜状平坦 菌落，逐渐变成淡黄，黄绿色，背面红色2周左右表面呈淡红色绒毛状，整个培养基被染成玫瑰红色,菌落特点,镜下形态,分生孢子梗大多从基质长出，或气生菌丝生长，每个梗基上簇生6-10个平行而略密的小梗
8、，形成特征性的帚状枝。,临床意义,橘青霉可引起肾脏的损害，有弱致癌性； 绳状青霉可引起大米变质并引起中毒； 马尔尼菲青霉引起皮肤结节，皮下脓肿及网状内皮系统感染，预后凶险。,链格孢属,培养特性 SDA培养基上28培养，生长迅速，形成棉絮状，后变为绿褐色至深褐色，背面为黑色。,镜下形态,分生孢子梗直立，暗色，分隔，单生或分枝状。分生孢子砖格状，倒棍棒状，有尖，光滑或粗糙，水平，垂直，或斜形分隔。,临床意义,链格孢可引起皮下组织脓肿和溃疡，还可引起足菌肿。,病例分析,现病史 女，78岁，天津东丽区人，患者因反复咳嗽咳痰、憋喘十余年加重5天、神志不清1天入院。入院5天前出现咳嗽咳痰加重，痰液呈黄粘状
9、不易咳出，于当地卫生院就诊，给予平喘消炎治疗（消炎药未知）未见好转，喘息加重。1天前神志不清，我院急诊查血气，显示II型呼衰，进行器官插管，收入ICU。,病例分析,既往史 长期吸烟史、糖尿病史、高血压史，长期使用“野药”（可疑激素）史。,病例分析,入院检查 体温37.2，昏迷、对光反射消失，双肺呼吸音粗，可闻及干湿性罗音，心率24 BPM，血压无法测出； 白细胞12.42*109/L，PCT 7.66 ng/ml，微生物动态真菌监测41.45 ng/ml。肺炎支原体培养阳性，痰培养为多重耐药鲍曼不动杆菌 肺CT提示：双肺下叶炎性病变，考虑右肺中叶膨胀不全，双肺间质性改变，双肺肺气肿，双肺索条状
10、及钙化点。,病例分析,病例分析,治疗及转归 给予阿奇霉素和舒普深治疗，同时使用甲强龙扩张气道平喘，不排除肺真菌感染的可能性，继续行痰培养和真菌培养检查 3月27日真菌培养结果为烟曲霉，加伏立康唑治疗。 3月30日，患者气道痉挛较前好转，喘憋减轻。 3月31日，PCT 1.03ng/ml，患者气道痉挛明显好转，喘憋减轻，适当下调呼吸机条件，双肺呼吸音低，可闻少量湿罗音。,病例分析,培养基,镜下形态,病例分析,治疗及转归 4月12日，脱机； 4月17日，两次痰真菌培养阴性，微生物动态真菌监测阴性，伏立康唑用足疗程，决定停药； 4月22日，脱机9日，患者COPD，但不能脱离无创机械通气辅助，提示预后
11、不良，家属拒绝再次插管； 4月25日，患者自动出院。,病例分析,病例分析,分析 患者入院痰培养提示多重耐药鲍曼不动杆菌，给予舒普深治疗； 后真菌培养提示烟曲霉感染，给予伏立康唑治疗后，病人病情明显好转； 继续行痰培养和真菌培养检测，痰培养依旧提示鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌； 考虑应用舒普深导致肠道菌群失调逆行入患者气道内所产生的感染，并非患者侵袭性肺病的根本病原菌。,病例分析二,现病史 女，65岁，河北省定州市人，入院前一周感咳嗽，为黄色黏痰，伴憋气，伴双下肢水肿，伴皮肤黏膜黄染加重，伴尿色加深，于2015年5月13日收入我院肝内病区。 既往史 患者自身免疫性肝硬化病史，曾行食道静脉曲张套扎治疗
12、，低蛋白血症，胆红素明显增高，肝功能储备差，应用激素治疗。 入院检查 肝病面容，皮肤巩膜重度黄染，体温36.0，白细胞9.16*109/L ，中性粒细胞百分比92.0%，HB 105g/L，PCT 0.35ng/ml。,病例分析,治疗与转归 5月14日，体温37，咳嗽咳痰，行痰培养检查； 5月15日，胸片提示：双下肺纹理增粗；患者长期服用激素，免疫力低下，易合并感染，考虑肺炎，给予拜福乐抗感染治疗； 5月20日，患者体温38.2，咳嗽、咳痰、痰中带血，CT提示双肺多发结节影及团片状致密影。,病例分析,5月21日，送检痰培养； 5月22日，痰培养回报怀疑曲霉菌感染，遂请呼吸科会诊，不排除曲霉菌感染，送检痰真菌培养，并加用伏立康唑。 5月25日，葡聚糖105.70 pg/ml，白细胞5.18*109/L，痰真菌培养提示烟曲霉。,病例分析,病例分析,病例分析,病例分析,5月27日，患者咳嗽咳痰较前好转，无痰中带血，体温正常。 5月28日，复查胸CT，双肺多发结节影及团片状致密影，较前吸收消散、数量减少。 6月2日，患者偶有咳嗽，咳痰较前明显减少； 6月4日，胸CT提示双肺多发空洞样病变，考虑炎性病变治疗后改变，患者出院。,谢谢聆听!,
