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1、植物原生质体培养 （补充）,The cultivation of plant protoplast （Complementarity）,李宏富,一、两个概念,再生植株工程植株,二、原生质体分离,1 材料来源植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。植株的年龄和生长条件是十分重要的。,来源： 无菌苗 温室培养的苗 培养条件：低光照强度（1000lx）短日照 温度为2025 相对湿度为60%80%以及充足的氮肥供应。,2 前处理 要保证酶解能充分的进行，必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。
2、为此，要做到：撕去叶片的下表皮，以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶液中。或把叶片切成小块，结合真空处理效果更好。或用金刚砂摩擦叶的下表皮。,3 提取方法,机械分离法（Machanical isolation）酶法分离（Enzymatic isolation）,早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机械法分离原生质体。方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织，在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能用此法。,机械法,酶解法,1960年Norkingh
3、an大学的植物生理学家Cooking用酶法降解细胞壁，获番茄根尖原生质体，开创了大量获得原生质体的的方法。20世纪九十年代以来，国内外原生质体培养取得了突飞猛进的发展。 1971年，Takebe等人在烟草上首次由原生质体培养获得植株。至今已获得酶法制备植物原生质体操作方法。,材料准备：植物的幼嫩部分幼叶、根、下胚轴，亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。材料预处理：叶片萎焉处理日光下28小时叶片预培养如羽衣甘蓝诱导愈伤组织培养基培养7天后预先质壁分离糖溶液中质壁分离, 酶解,纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase） 半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶
4、,原生质体分离常用的商品酶酶 来源 生产厂家 纤维素酶类 onozuka R10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit
5、, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA,纤维素酶从绿色木霉中提取。用于活力不同：P1500、P5000、 OnozukaR-10 （常用） 果胶酶（离析酶）从根霉、黑曲霉中提取。浓度若超过2，分离时间过长，均易产生毒害。常用(Ma
6、cerozymeR-10)。半纤维素酶从黑曲霉中提取。常用于从愈伤组织中分离原生质体；常用Rhozyme HP-150；蜗牛酶分离孢粉素、胼胝质。,步骤：二步法：离析酶纤维素酶 一步法：复合酶处理 优点：可获得大量的原生质体，几乎适用于所有植物的器官、组织和细胞。 缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、酚类等物质，影响原生质体的活力。,注意事项：酶溶剂及其渗透压酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等浓度范围450800mmol/L酶处理：酶浓度 酶解时间 酶解温度,图示：原生质体分离过程（以叶片为例）,过滤、离心,加果胶酶 和纤维素酶,三、原生质体的纯化,材料在
7、酶液中一段时间后，轻轻振动容器或挤压叶片，使原来组织中的原生质体释放出来。此时还有一些亚细胞碎屑，尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体，因此必须除去。,离心沉淀法,原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。 步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（5001000rpm,离心56min）。第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心沉淀。如此23次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。,漂浮法,原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液
8、培养基的界面上。,界面法,500mmol/L蔗糖,140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇,原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。,100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇 +原生质体,Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.,a Friable embryogenic calli, b suspension cell aggregates, c freshly isolated protoplasts from suspens
9、ion culture, d protoplasts stained with FDA, e division of cell derived from protoplasts, f cell colonies derived from protoplast, g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose, h green shoot formation, i fertile green plant,a: first division, 10 days after protoplast isolation b,c: 2
10、 and 3 wo microcolonies. d,e: 4 and 6 wo microcalli f: 8 wo microcalli just before being transferred onto B5 medium,a,b,c,d,e,f,i,h,g,Recovery of plantlets through somatic embryogenesis,g: Transfer of microcalli onto B5 medium and induction of somatic embryos. h: Transfer of globular embryos onto B5
11、 medium for maturation of somaticembryos. i: Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.,四、原生质体培养研究进展,膜片钳技术 1976年1德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱
12、，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。,非对称细胞融合技术所谓非对称细胞融合技术，即利用某种外界因素(常为射线，即融合gamma-fusion)辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核；并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使其细胞质失活，然后融合来自这两个原性质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时，改良其某个不良性状。,谢谢,
