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1、第三章 生物制品的制备Preparation of biopreparate,第一节 一般生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate ),一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （Selection、pretreatment and preservation of raw material of biopreparate）,（1）原料选择原料的选择原则：有效成分含量高，新鲜；原料来源丰富，产地较近；原料中杂质含量少；原料成本低等。,原料的选择注意事项：植物原料生长的季节性；微生物原料的对数期；动物原料的年龄与性别。,（2）原料的预处理与保存
2、： 动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。 植物原料：要择时采集并就地去除无用的部分，保鲜处理； 微生物原料：要及时将菌体细胞与培养液分开，进行保鲜处理。,原料的保存方法主要有：,冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40速冻。 有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。 防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。,二、生物制品的提取（extraction） (1)生物组织与细胞的破碎（smash of tissue and cell）：生物制品大部分存在于生物
3、组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法： 磨切法，该法属于机械破碎方法，设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。 压力法，有加压与减压两种，常用的法兰西压釜、细菌压等使用效果良好。,反复冻融(freeze thawing)法，设备简便，活性保持好，但用时较长。 超声波振荡破碎(ultrasonic oscillation crash)法，该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。 自溶法(autolyze method)或酶解法(enzymolysis method)，用得较少。,（2）提取（extraction）生物组织与细胞破碎后要立即进
4、行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。注意提取的温度、pH、变性剂等因素。,三、蛋白质类制品的分离纯化方法（Separation and depuration of protein production） 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： (1)沉淀法（precipitation）：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法（salting out）、有机溶剂沉淀法（organic solvent
5、precipitation）、等电点沉淀法（isoelectric precipitation）、与靶物质结合沉淀法（如抗体抗原）（target banding precipitation）等。,(2) 按分子大小分离的方法：有超滤法（ultrafiltration）和透析法（dialysis）（即膜分离方法）、凝胶层析法（gel chromatography）、超速离心法（ultra centrifugation）等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。,(3)按分子所带电荷进行分离的方法 氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点(pI)，在离开等电点的pH时便
6、会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为7.0，当溶液pH为4.0时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有离子交换柱层析法（ion-exchange chromatography）、电泳法（electrophoresis）、等电聚焦法（isoelectric focusing）等。,（4）亲和层析法（affinity chromatography） 大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物(Substrate)（或抑制剂(inhabitor)）、抗原与抗体、激素(hormone)与受体(receptor)等，它们之间有特异的亲
7、合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。 亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。 另外，最近出现的新方法还有疏水层析（hydrophobic chromatography）等。,四、核酸类制品的分离纯化方法 （Separation and purification of nucleic acid ） 核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产DNA和RNA，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离RNA与DNA。发酵法主要用于生产单核苷酸。0,五、糖类制品的分离纯化方法 （Separation and purification of
8、 glucide ）由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。,（1）提取方法 （extraction）非降解法(nondegradation)适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。降解法（degradation）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖（mucoitin）。如从软骨中分离提取硫酸软骨素（chondroitin sulfate），就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。,（2）分离方法 （Separation）常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉
9、淀法（alcohol precipitation）：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。4-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（CTA）等。,离子交换层析法（ion exchange chromatagraphy)：粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如Dowex I-X2（商品名）离子交换树脂、DEAE-离子交换纤维素（二乙胺乙基）等。洗脱可用NaC1溶液进行梯度洗脱。,六、脂类制品的分离纯化方法 （Separation and puri
10、fication of lipid） （1）提取方法（extraction ）脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。,（2）纯化方法（purification） 沉 淀 法(precipitation) ：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。 吸附层析法(adsorption chromatography)：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用
11、极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。,离子交换层析法(Ion exchange chromatography) : 脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一定pH条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如TEAE纤维素(Triethylaminoethyl cellulose)对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。,七、氨基酸类制品的分离纯化方法 （Separation and purification of Aa） （1）氨基酸的生产方法 (production of Aa) 蛋白质水解法(protein hydrolysis)：水解法有酸
12、水解(acid hydrolysis )、碱水解(base hydrolysis)和酶水解(enzyme hydrolysis)三种。,用盐酸水解(HCl hydrolysis)为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。 碱水解法(alkali hydrolysis)易产生消旋作用，较少应用。 酶水解法(enzyme hydrolysis)水解不够完全。,发酵法(fermentation)： 菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。 化学合成(chemosynthesis)与酶促合成法(enzyme catalyzed synthesi
13、s) 化学合成法一般得到的是DL型氨基酸，尚需要对异构体拆分；酶促合成法也是酶工程在医药工业上的应用，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。,（2）氨基酸的分离方法(Separation of Aa )有沉淀法(precipitation) 、吸附法(adsorption)和离子交换法（ion-exchange ) 。 沉淀法(precipitation)：根据形成沉淀的原理不同分为两种：是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。,吸附法(adsorptio
14、n)：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。 离子交换法（ion-exchange )：氨基酸是两性电解质，在一定pH条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用pH梯度洗脱。,第二节 人体来源生物制品制备实例 （Example of bio-preparate application to human）一、人血浆白蛋白制剂的制备 （preparate of human blood plasma albumin ）血（无抗凝剂
15、）自然凝固分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）,血+混合抗凝剂,草酸铵 草酸钾,离 心,上清血浆,总蛋白：6.2-7.9% 白蛋白：3.8-4.8% 水：90-92%,（现常用肝素、柠檬酸钠）,（1）结构和性质 （structure and character） 白蛋白（albumin）又称人血浆白蛋白，约占血浆总蛋白的65%。是维持血浆胶体渗透压的主要物质。 白蛋白为单链分子pI为4.7，易溶于水，在60%硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。 从人体中分离的白蛋白有两种：人血浆白蛋白和胎盘白蛋白。,（2）工艺路线（图3-1）,2%利凡诺、NaHCO3,pH8.6,离心分离,络合物
16、,蒸馏水NaCl、HCl,弱酸性，65，离心,离心液,浓缩,超滤,浓缩液,灭活病毒,65/h，60/10h,热处理液,除菌,除菌过滤,白蛋白液,干燥,冷冻干燥,白蛋白,图3-1 白蛋白生产工艺路线,去杂蛋白,人血浆（%）,（3）工艺要点 络合（利凡诺沉淀）：搅拌血浆用NaHCO3调pH至8.6，加等体积2%利凡诺溶液，搅拌后静置2-4h，分离上清与络合物沉淀。 解离：在沉淀中加灭菌蒸馏水。用0.5mol/L HCI调节pH至弱酸性，加NaCl至0.15%-0.2%，搅拌下进行解离。,去杂蛋白：65恒温1h，离心分离出上清液。 热处理（60，10h）：灭活病毒。 冻干品白色疏松物体。白蛋白含量占95%以上，水分1%，水溶后pH为6.6-7.2，硫酸铵残量0.01%，细菌学和热原质检测合格。,二、尿激酶（urokinase）的制备 （1）天然尿激酶是由两条肽链通过二硫键连接而成。是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸、组氨酸是活性中心必需的氨基酸。该酶底物专一性很强，血纤维蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白质底物，作用于Arg-Val键上，使纤溶酶原转为纤溶酶。 （2）尿激酶的pI为8-9。溶液状态不稳定。用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。,
