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1、第二章 细胞生物学研究方法,METHODS AND TECHNIQUES,第一节 显微镜技术,一、光学显微镜技术 普通光学显微镜 相差显微镜 微分干涉显微镜 暗视野显微镜 荧光显微镜 激光扫描共聚焦显微镜 二、电子显微镜技术 透射电镜技术 扫描电镜技术 三、扫描隧道显微镜技术,（一）普通光学显微镜,1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像， 经目镜放大成虚像。,一、光学显微镜技术,3.分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。(肉眼、光学显微镜、电子显微镜的分辨率分别为0.2mm、0.2m和0.2nm ) 光学显微镜的分辨力 R=0.61/NA 其中为入射光线
2、波长； NA为镜口率 sin/2， n=介质折射率； =镜口角（样品对物镜镜口的张角） 光学显微镜理论放大倍数可以达到1500倍，但由于受到可见光光源衍射效应的限制，其有效放大倍数只能达到1000倍。,Preparation of specimen,取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察,1. 用于观察活体细胞； 2. 特殊之处： 环形光阑：位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 环形相板：在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。 3. 原理 把光程差变成振幅差，提高了各种结构间的对比度，使其清晰可见。,（二）相差显微镜
3、,相差显微 镜光路图,莱卡相差显微镜 （物镜与照明系统颠倒 ）,用途：适用于观察活细胞和活组织，是体外细胞和组织培养不可或缺的工具。,插入动态视频,DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,1.利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，与相差显微镜相比，分辨率更高，图像立体感更强。其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 2.使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如细胞核、线粒体等立体感增强，适合显微操作。常应用于基因注入、核移植、转基因等操作。,（三）微分干涉显微镜,（四）暗视野显微镜,1.原理：与来自缝隙的一束强光通过暗室时可清楚地看到其中细微灰尘现象相同。在漆黑的视野中，由于反差增大了，使样
4、品显得更清楚。（丁达尔效应） 2.用途：观察生活细菌及细菌运动；鉴别细胞的死活；观察细胞核、线粒体等细胞器与细胞中的线状结构，以及单细胞有机体、硅藻、放线菌类；此外还可用来观察娇弱的微生物。,(A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. The other images were obtained by techniques discussed
5、 in the text: (B) phase-contrast microscopy, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D) dark-field microscopy.,（五）荧光显微镜,1.原理： 2.特点： 照明方式通常为落射式 光源为紫外光，波长短，分辨率高于普通显微镜 有两个特殊的滤光片 3.应用：通常与免疫荧光细胞化学结合，对细胞内的物质进行定性和定量的研究。,荧光显微镜照片 （微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,细胞形态观察、细胞内生化成分定性定量分析,（六）激光共聚焦扫描显微境,用激
6、光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 扫描不同层次，显示细胞样品的立体结构。 用途类似荧光显微镜，但能改变焦点获得样品不同切面上的图像，叠加后便可重构样品的三维结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍，比荧光显微镜分辨率高1.41.7倍。,laser confocal scanning microscope, LCSM,（七）当代显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。,二、电子显微镜技术,（一）扫描电镜技术 1.工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集
7、，信号经放大显示出与电子束同步的扫描图像。 2.应用：观察样品标本的表面结构。图像为立体，反映了标本表面的真实结构。（与透射电镜比较）,Scanning electron microscope（ SEM）,SEM LIGHT PATHWAY,Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog（牛蛙内耳毛发细胞） (A). For comparison, the same structure is shown by differenti
8、al-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).,Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.,（二）透射电镜技术,透射电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样。用于观察样品内部亚显微结构或超微结构。,Principal features of a light microscope, a transmi
9、ssion electron microscope, and a scanning electron microscope. These drawings emphasize the similarities of overall design. Whereas the lenses in the light microscope are made of glass, those in the electron microscope are magnetic coils.,电镜与光镜的比较,2.光镜与电镜的主要区别,光源不同：光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束 透镜不同 ：光镜为玻璃；电镜为电
10、磁透镜 真空：电子束运动轨迹不受空气干扰；空气对样品的污染；灯丝 的氧化损伤。 显示记录系统,3.电镜的构造,Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions.,4.主要电镜制样技术,1）超薄切片技术：由于电子束的穿透能力有限，为获得较高的分辨率，电镜切片的厚度一般仅为4050nm。,2）负染技术,用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,Negative Stained
11、 Archaebacteria,Electron micrograph of negatively stained actin filaments. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.),3）冷冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术,Preparation of a metal-shadowed replica of th
12、e surface of a specimen. Note that the thickness of the metal reflects the surface contours of the original specimen.,Freeze-fracture electron micrograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell. These membranes, which carry out photosynthesis, are stacked up in multiple layer
13、s. The largest particles seen in the membrane are the complete photosystem II-a complex of multiple proteins.,Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy,电镜三维重构技术与X射线衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学中研究生物大分子空间结构及其相关性的主要实验手段。,Three-dimensional reconstruction from serial sections. Single thin sections
14、 sometimes give misleading impressions. In this example most sections through a cell containing a branched mitochondrion will appear to contain two or three separate mitochondria. Sections 4 and 7, moreover, might be interpreted as showing a mito-chondrion in the process of dividing. The true three-
15、dimensional shape, however, can be reconstructed from serial sections.,4）电镜三维重构技术,三、扫描遂道显微镜,1.原理 根据量子力学中的隧道效应设计，当外加一定电压的精密探 针接近物质时，由于隧道效应，在针尖与样品之间形成隧道电 流。电流强度与针尖和样品间的距离（物质表面原子凸凹不 平）有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 2.特点 （1）具有原子尺度的高分辨率。分辨率横向0.1nm,纵向0.001nm （2）可在真空、大气、液体等接近生理环境下工作,对固态、液态、气态物质均可观察
16、。 （3）非破坏性测量，扫描时不接触样品，避免样品的形态破坏。 （4）可连续成像，进行动态观察。 3.应用： 纳米生物学研究领域中的重要工具,可直接观察DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，也可生物膜、细胞壁等的原子布阵。,扫描隧道显微镜原理,引自http:/www.iap.tuwien.ac.at,第二节 细胞组分的分析方法,一、离心分离技术 差速离心技术 密度梯度离心技术 二、细胞化学技术 酶化学技术 免疫细胞化学技术 放射自显影技术 三、定量细胞化学分析技术 显微分光光度测定技术 流式细胞术,一、离心技术,分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。 沉降系数：当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度。,（一）差速离心 Differential centrifugation,1.原理：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 2.特点 介质密度均一 速度由低向高，逐级离心。 3.沉降顺序 核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 4.可将相差悬殊的细胞和细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,
