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1、,植物细胞培养,植物细胞培养基本原理及主要实验技术,生物合成药物,历史沿革,基本原理,主要实验技术,历史沿革,1、早期尝试期 2、基础研究期 营养 3、新技术建立时期 原生质体融合 植物细胞固化 质粒转化原生质体 体细胞克隆与变异 4、植物生物技术期 与基因工程结合 产业化,基本原理,灭菌,培养基,培养,保存,1植物材料灭菌前处理、表面灭菌剂、内感染 2培养基湿热、过滤 3器皿和工具干热、湿热、火焰灼烧 4培养室 5无菌技术 超净工作台 100级,灭菌,水 双蒸水以上 无机盐 大量 微量 有机成分碳源 蔗糖 葡萄糖氨基酸几种常用的有能力合成，但刺激生长 产物合成前体多种混合维生素有能力，但不够
2、几种常用的,培养基,生长调节剂生长素细胞激动素促进分裂打破顶芽休眠促进茎的分化赤霉素和脱落酸 不确定成分混合物 其他物质琼脂活性炭去除植物细胞产生的酚类、氧化物、丹宁 PH 灭菌前5-6,培养基,仪器设备常用仪器设备培养器皿和设备实验室设置 培养条件温度 低于植物生长温度3-4光照 用于分化的细胞和光自养型细胞氧 培养类型愈伤组织 生长迅速 疏松 非褐化单细胞培养悬浮细胞培养大量培养 发酵罐 生物反应器植物细胞与微生物比较固定细胞培养 特点转化细胞培养,培养,主要实验技术,愈伤组织培养单细胞培养悬浮细胞培养大量培养固定细胞培养转化细胞培养细胞保存,愈伤组织培养,1外植体的选择 外植体的来源 部
3、位 年龄 生理状态外植体的大小 2培养基的配制培养基的配制 大量成分 微量成分 有机成分 铁、激动素 按比例混合 调酸碱 定容 分装 灭菌定容后加琼脂 融化 定容培养基的选择 外植体 培养基 生长素 激动素四因子 3愈伤组织的诱导接种材料的灭菌茎段和叶：蜡质 表面活性剂擦种子：一般的采用茎段和叶片的方法根和地下器官 无菌操作 愈伤组织的培养,单细胞培养,1单细胞的分离机械法酶法悬浮培养法 愈伤组织在振荡器中培养，过滤得到单细胞 2单细胞的培养看护培养：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。铺板培养微室培养,悬浮细胞培养,悬浮细胞培养的建立细
4、胞系的建立 松散色淡的愈伤组织转入悬浮五代以上 培养 接种量1/5、1/2、1/10继代培养 生长模式 封闭系统中S型曲线 培养基的选择培养基的特点 酸碱缓冲能力差 生长素的浓度条件培养 低密度培养液中放高密度培养悬浮细胞的透析袋 细胞生活力和生长的测定生活力测定 荧光素二乙酸酯法、伊万兰染色法 细胞生长的测定细胞计数法、干重、鲜重、堆积细胞体积法,大量培养,1高产细胞系的筛选 颜色目视（紫草素） 化学分析（生物碱） 2种子的准备 逐级继代培养 3生物反应器的设计 获得产品生物反应器 得到细胞发酵罐 4培养条件的最适化 混合、通气、剪切力、温度、PH 5培养系统的操作成批培养、半连续培养、连续
5、培养 6测定方法 电导率测定、kla测定,固定细胞培养,细胞固定在胶体中固定植物细胞在网或泡沫中固定空心纤维膜中固定 固定细胞反应器的设计 流动床式 固定床式,转化细胞培养,转化根瘤农杆菌转化细胞的建立 叶片 悬浮液 不要没过 诱导愈伤组织转化细胞的培养 农杆菌质粒中携带生长素基因 转化细胞的分析转化细胞的筛选 抗性基因 报道基因 标记基因外源基因表达 产物积累（生物、免疫、化学）,细胞保存,冷冻保存冷冻慢冻快冻 茎尖保存分部冻 茎尖 芽 悬浮培养 慢 中间温度30min 液氮快干冻 真空脱水 液氮保藏维持融冰 液氮迅速37-40度90s后 室温再培养 冷藏保存 1-9度下仍需继代培养 低压保
6、存 低氧保存,植物细胞中主要 生理活性物质 和其他化学组分,植物细胞技术 的优缺点,应用实例,一,二,三,01,1.生理活性物质 （1）酶类:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶 （2）维生素:辅酶 （3）植物激素 （4）抗生素和植物杀菌素:蒜，葱，萝卜,01,2.其他成分（后含物） （1）生物碱:罂粟科，茄科 （2）糖苷类:洋地黄毒苷 （3）挥发油:薄荷油，丁香油 （4）有机酸:苹果酸，柠檬酸，水杨酸,03,工业化产品 希腊毛地黄细胞 生物转化 地高辛 日本黄连细胞 黄连碱 人参根细胞 人参皂甙 中试水平 长春花 吲哚生物碱 丹参 丹参酮 青蒿 青蒿素 红豆杉 紫杉醇 紫草 萘醌 三七 皂甙,02,1、不
7、受地区、季节、土壤及有害生物的影响 2、节约农田 3、在无菌条件下完成的, 能排除病菌及虫害对药用植物的侵扰; 4、研究植物的代谢途径, 探索或创造新的合成路线 5、人工控制提高代谢物产量,优点,02,(1)生长周期长,易污染。 (2)生物反应器的设计装置要求较高。 (3)高产细胞株较难获得。,缺点,03,发状根、冠瘿组织细胞培养技术,激素自主增殖快常规细胞次生代谢物含量高、种类广悬浮培养细胞桔味薄荷冠瘿细胞 萜烯洋地黄冠瘿细胞 强心甙丹参冠瘿细胞 丹参酮长春花冠瘿细胞 吲哚生物碱人参发状根培养 人参皂甙长春花发状根培养 长春碱青蒿发状根培养 青蒿素萝芙木发状根培养 生物碱,03,两相培养技术
8、,培养体系形成上、下两相,细胞在水相中生长与合成次生物质,然后分泌出来转移到有机相中。减少反馈抑制产量提高有机相循环使用,连续培养,成本降低长春花细胞 XAD-7大孔吸附树脂 吲哚生物碱花菱草悬浮细胞 液体硅胶 血根碱,03,美国 白细胞介素荷兰 转基因马铃薯 血清白蛋白南朝鲜 转基因烟草和番茄 人胰岛素BoyceThompson研究所 马铃薯 食用霍乱疫苗美国 开发研究烟草 治疗人类高歇氏病和费勃莱氏病的酶新思路：以病毒为载体在植物中生产药用蛋白，还处在实验阶段,药用蛋白,(1)易吸收 (2)安全 (3)简化下游纯化工艺,谢谢观赏！,卜学贤，陈维伦.活性炭在植物细胞组织培养中的作用褐化与植物材料基因型、生理状态、取材时期、培养基、培养条件,最佳继代时期为2或3,
