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1、抗真菌药物敏感试验,沈 永 年,概 述,真菌感染的发病率,尤其是深部真菌感染的发病率逐渐增高 大量新型抗真菌药物不断涌现 临床耐药菌株的出现抗真菌药物敏感实验为临床耐药菌株的发现，抗真菌药物的选择提供指导。,概 述,抗真菌药物敏感实验方法是建立在抗细菌药物敏感实验方法基础之上 由于真菌是一种高等的生物，其繁殖方式、生长周期、生长条件等均与细菌不同，因此抗真菌药物敏感试验一直是国内外学者研究的难题。因此，实验方法多样化，但尚无通用的标准方法。 美国国家临床试验标准委员会（NCCLS）从1992年起，制订了一系列针对抗真菌药物敏感实验的指导性文件，但目前仍不能适用于所有医学真菌的检测。,抗真菌药敏
2、试验目的,指导抗真菌药物的选择 测定抗真菌药物对致病真菌的敏感性，提供临床用药量及预后监测的参考 筛选耐药菌株及研制对致病真菌有效的抗真菌药物提供临床应用,常见术语,最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）MIC50，MIC90，MIC5080 最低杀菌浓度（minimal fungicidal concentration MFC）MFC50，MFC90 最低有效浓度（minimal effective concentration，MEC ）,抗真菌药敏试验方法,药基法琼脂稀释法试管（液体）稀释法微量液体稀释法 菌基法（琼脂扩散法）ROSCO抗真
3、菌药敏纸片法E试验法（Etest）,酵母样真菌药物敏感试验,酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验于1992年由美国国家临床试验标准化委员会（NCCLS）提出标准实验方案（M27P）以来，几经修订，目前已由M27A2取代。此外，其他药物敏感试验方法如琼脂稀释法，琼脂扩散法，E试验法等时有应用。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),药液的制备 储存液：浓度至少为1280g/mL或10倍于受试的最高浓度。储存液浓度需根据药物本身溶解性决定。氟康唑和5氟胞嘧啶（5FC）以灭菌蒸馏水溶解；酮康唑、伊曲康唑、两性霉素B、伏力康唑等采用DMSO溶解。储存液分装后置60 保存。解冻后的储存液应在24h内使
4、用，不得重复冻存使用。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),药液的制备使用液： 水溶性药物以无菌蒸馏水将储存液倍比稀释至工作液浓度（10倍测试浓度）。非水溶性药物则需将储存液用DMSO倍比稀释至100倍测试浓度，再采用无菌蒸馏水稀释至工作液浓度（10倍测试浓度），以防止药物的析出。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),培养基的制备2倍浓度RPMI 1640培养基（不含NaHCO3）作为标准培养基，用0.33mol/L MOPS缓冲液溶解,调节pH值至6.97.1（室温），过滤除菌，4可保存4周。在培养基中加入4%葡萄糖可促进菌生长，帮助终点的判断。,试管液基稀释法 (NCCLS-M
5、27A),菌液的制备受试菌在SDA或PDA中35 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌）。取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于11065106/mL，作为菌液的贮备液。使用时，采用2倍量培养基将菌液调整至工作浓度为1.01035.0103/mL。再用无菌蒸馏水倍比稀释成0.51032. 5103/mL。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),实验步骤： 取无菌的15mm100mm试管进行实验 在试管中依次加入0.1mL倍比稀释的不同浓度药物工作液。 依次在试管中加入0.9mL菌工作
6、液，混匀。注意整个过程需在15min内完成。 实验过程中，设置空白对照和生长对照。同时进行质控菌株平行试验，进行质量控制。 将试管置于35 培养4650h观察结果。对于新生隐球菌，培养时间应延长至7074h。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),结果判读 两性霉素B终点的判断比较容易，无肉眼可见生长的最低药物浓度为两性霉素B的MIC值。 氟胞嘧啶及唑类往往在最低浓度时也可出现轻度浑浊。此时，可取生长对照管中菌悬液0.2mL，加入培养基0.8mL混匀作为判断终点的浊度（即80菌的生长受到抑制时的浊度)，与此浊度相近的试管即可判定为终点，其药物浓度为该药的MIC值。,试管液基稀释法 (NCC
7、LS-M27A),结果的判定 新三唑类药物酵母菌的MIC值为0.0316 g/mL，大多数酵母菌的MIC值小于1 g/mL。目前尚无资料说明MIC值与临床疗效之间的关系。氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑判定标准如下表所示。氟康唑的判定标准不适用于克柔念珠菌。采用不适当的溶媒溶解伊曲康唑可导致结果偏差。,念珠菌体外药物敏感试验的结果判定标准,注：如果测定的MIC值位于上述分类之间，则将该菌划分入 高一级类别中,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),注意事项 测试药物的浓度范围应包括终点浓度和质控株的MIC范围。一般常见药物的测试浓度范围：两性霉素B 0.031316g/mL； 氟胞嘧啶0.1256
8、4 g/mL ；酮康唑0.031316 g/mL； 伊曲康唑0.031316 g/mL；氟康唑0.12564 g/mL， 新三唑类药物（如伏力康唑等）0.031316 g/mL。,试管液基稀释法 (NCCLS-M27A),注意事项 测试过程中，需进行生长空白对照、空白对照、质控菌株对照。 应选择对抗真菌药物无拮抗作用的缓冲液溶解RPMI 1640培养基，如MOPS。Tris缓冲液、PBS缓冲液因可与药物存在相互作用而不适用。 培养基pH值可能影响测试结果，应严格控制pH值于6.97.1。,微量液体稀释法,药液（储备液和工作液）的制备储备液的制备同试管稀释法。与试管稀释法不同，微量稀释法的工作液
9、浓度是测试浓度的两倍。 培养基的制备：同试管稀释法 菌液（储备液和工作液）的制备菌储备液的制备同试管稀释法，但工作液浓度稀释调整至两倍测试浓度（即11035103/mL）即可，不需再用无菌蒸馏水倍比稀释。,微量液体稀释法,试验步骤1. 药敏板的制备：采用96孔U型板，每排110孔依次加入不同浓度待测药物工作液100 l，第1孔为最高浓度，第10孔为最低浓度。制备好的药敏板可用塑料薄膜包裹后置70保存6月以上。2. 取制备好的药敏板，在110孔加入100l菌工作液，第11孔中加入100l无菌蒸馏水和100l菌工作液，作为生长对照；12孔仅加入无菌不含药物培养基作阴性对照。3. 将培养板置于35
10、孵育48小时(新生隐球菌为72小时）后读取结果。,微量液体稀释法,结果判读观察前，可轻轻震摇药敏板，使终点判读更容易。如果出现菌膜沉淀，须进行吹打、涡旋或其他方法混匀后，在进行结果判读。结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情况进行评分：0：完全透明清澈； 1：轻度浑浊2：浊度较生长对照明显下降；3：浊度较生长对照轻度下降； 4：浊度与生长对照一致。,微量液体稀释法,结果判读两性霉素B：以评分为0的最低药物浓度 为MIC值 5FC和唑类：评分为2的最低药物浓度作为MIC值。通过分光光度计检测显示，此时大约50菌生长受到抑制。结果判读可缩短至24小时，只要第11孔有菌生长即可进行，对结果无明显影响
11、。,琼脂稀释法,将琼脂平板中掺入不同浓度的抗真菌药物，以多点接种法将待测真菌接种于琼脂表面（各点所种真菌量相同），以菌不生长的最低药物浓度定为该药对真菌的MIC。优点：可同时测定多个菌株，易于确定终点。比液体稀释法重复性好。缺点：方法繁琐，耗时长。,琼脂稀释法,药液的制备：同试管液基稀释法，工作液浓度为10倍浓度的测试浓度，各种常用药物的浓度测试范围为：两性霉素B 0.031316g/mL； 氟胞嘧啶0.12564g/mL 酮康唑0.031316g/mL ； 伊曲康唑0.031316g/mL 氟康唑0.12564g/mL ； 新三唑类药物（如伏力康唑等）0.031316g/mL。,琼脂稀释法,
12、培养基制备 RPMI 1640培养基:2倍量:RPMI 1640 20.8g,葡萄糖40g, 以0.33M MOPS缓冲液溶解,调整pH值至6.97.1,过滤除菌,置-20保存。 HR培养基：2倍量：29.3g HR培养基，NaHCO3 2.0g，溶于1000mL双蒸水中，调整pH值至7.5，过滤除菌，低温保存。 4琼脂：40g 琼脂，溶于1000mL蒸馏水中，高压灭菌15min，备用。,琼脂稀释法,菌液的制备受试菌在SDA中35 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌）取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个
13、麦氏单位浊度，相当于11065106/mL，作为菌液的工作液。,琼脂稀释法,药物平板的制备 将RPMI 1640培养基或HR培养基置60预温。取4琼脂，加热融化后，置60，保温。 将培养基和琼脂1:1混匀，分装入试管中，每管分装13.5mL，仍置60保温。 将不同浓度药液（工作液）1.5mL加入试管中，轻轻震摇混匀，倒入平皿，置水平桌面使之凝固，注意混匀时避免出现气泡。37， 15分钟，使干燥。 如采用平板多点接种，可将培养基18mL，加入不同浓度药液2mL，混匀倒入9cm直径平皿，制成药物平板备用。,琼脂稀释法,接种和培养 在药物平板中接种测试菌液，每点接种15l，可进行多点接种。并设置生长
14、对照平皿，空白对照平皿和标准菌株对照。 37 培养48h或72h（新生隐球菌） 终点判定：确定生长对照菌生长良好，空白对照无污染菌生长。逐一观察从高浓度至低浓度平皿上的生长情况，以菌不生长平皿的药物浓度作为对该菌的MIC值。,琼脂扩散法,将待检菌掺入琼脂培养基内，将浸有固定浓度的抗真菌药液纸片置于琼脂培养基表面，经孵育后，根据纸片周围真菌生长被抑制的范围大小确定药物对真菌的抑制作用。如同时应用系列浓度纸片，尚可测出MIC值。优点：简单、易行、不需复杂设备缺点：单一浓度纸片仅能定性，不能确定MIC值。药物纸片的标准化问题。,琼脂扩散法,培养基制备基本培养基为MH琼脂，其中加入2%葡萄糖和亚甲基兰
15、（0.5g/mL）。调整pH值至7.27.4（室温下）。高压灭菌后分装入平皿，室温下冷却凝固后，37温箱中干燥1030min，以去除平皿表面水蒸气。培养基平皿可在28 冰箱保存一周。如采用塑料袋包裹可适当延长。使用前，应抽取同一批次平皿置于3035孵箱中24小时，以确定无污染。,琼脂扩散法,药液纸片制备：商品化药液纸片：应保存于14以下冰箱中。使用前，应提前取出置于室温中平衡12小时。,琼脂扩散法,菌液制备同试管稀释法，受试菌在SDA或PDA中35 培养24小时（念珠菌属）。取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个浊度
16、单位，相当于11065106/mL，作为菌液的贮备液。,琼脂扩散法,操作步骤： 用棉签蘸取菌液涂于平板上，重复三次，每次将平板旋转60o再进行涂布，最后涂布平板边缘。 将浸有药液的纸片贴于琼脂表面，可轻微加压保证纸片与琼脂贴合紧密。纸片与纸片中心距离一般大于24mm。通常，150mm平板纸片数量不超过12个；100mm平板不超过5个。由于药物扩散在接触时即已进行，因此，当纸片接触平板后即不可再移动。 将贴有纸片的平皿翻转后置35培养2024小时，观察结果。如24小时菌生长不良，可将培养时间延长至48小时。,琼脂扩散法,结果判读药物对受试菌有生长抑制时，可围绕纸片形成抑制环。以明显受抑制的环边缘作为边界，测量抑制环大小。环边缘针尖大小菌落或环内的大菌落可忽略不计。,琼脂扩散法,
