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1、2.5 生物学指标的测定,细菌总数的测定,指1ml水(或1g样品),在普通琼脂培养基中经37、 24h培养后所生长的细菌菌群总数。 评定水体污染程度指标之一。 生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)规定每毫升水的细菌总数不得超过100个。,水中通常存在的细菌大致可分为三类: 天然水中存在的细菌。普通的是荧光假单孢杆菌、绿脓杆菌,一般认为这类细菌对健康人体是非致病的。,荧光假单胞杆菌,细菌分类,肠道细菌。它们生存在温血动物的肠道中,故粪便中大量存在。水体中发现这类细菌,可以认为已受到粪便的污染。致病性肠道细菌有沙门氏杆菌(伤寒和副伤寒菌)、B型炭疽菌、痢疾志贺氏菌和霍乱弧菌等。 土壤细菌。
2、当洪水时期或大雨后地表水中较多。它们在水中生存的时间不长,在水处理过程中容易被去除。腐蚀水管的铁细菌和硫细菌也属此类。,大肠杆菌,铁细菌,平板计数法,国标规定的方法为平板计数法 检验方法:在玻璃平皿内,接种一毫升水样或稀释水样于加热液化的营养琼脂培养基中,冷却凝固后在37C培养24小时,培养基上的菌落数或乘以水样的稀释倍数即为细菌总数。 精度高,耗时长。为了简化检测程序、缩短检测时间,国内外学者进行了大量的快速检测方法的研究,提出了阻抗检测法、Simplate TM全平器计数法、微菌落技术、纸片法等检测方法。,平板计数法,总大肠菌群的测定,总大肠菌群:需氧及兼性厌氧的在35、48h之内生长时能
3、使乳糖发酵、产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌,以每升水样中所含有的大肠菌群的数目表示。总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群,也包括存在于其他环境中的大肠菌群。 包括:大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌 生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)规定每100mL水不得检出总大肠菌群。,革兰氏染色法,细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。未经染色之细菌,由于其与周围环境折光率差别甚小,故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定。 革兰氏染色属复染法。 革兰氏染色法能够把细菌分为两大类,革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。 染
4、色的差异主要由阴性与阳性细菌细胞壁的差异引起。,革兰氏染色法,先用龙胆紫(亦称结晶紫)来染细菌,所有细菌都染成了紫色 涂以革兰氏碘液,来加强染料与菌体的结合 用95%的酒精来脱色2030秒钟,有些细菌不被脱色,仍保留紫色,有些细菌被脱色变成无色 用番红或沙黄复染1分钟,结果已被脱色的细菌被染成红色,未脱色的细菌仍然保持紫色,不再着色 凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌(G+菌);染成红色的称为革兰氏阴性菌(G-菌)。 常见的革兰氏阳性菌:葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等; 常见的革兰氏阴性菌:痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及霍乱弧菌等
5、。,多管发酵法,配制培养基 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于 30的暗处,存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化,或体积变化明显时废弃不用。 初步发酵试验 水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在 370.5下培养24h2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起的为阳性。,多管发酵法,复发酵试验 微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管,用 3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到 EC 培养液中。在 44.50.5温度下培养 24h2h(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面) 。接种后所有发酵管必须在
6、30min 内放进水浴中。培养后立即观察,发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。,多管发酵法,结果计算,滤膜法,滤膜是一种微孔性薄膜。 将水样注入已灭菌的放有滤膜(孔径 0.45m)的滤器中,经过抽滤,细菌即被截留在膜上,然后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上,37温度下进行培养,计数滤膜上生长的此特性的菌落数,计算出每 1L 水样中含有大肠菌群数。,滤膜法,将滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中煮沸灭菌三次,每次 15min。前两次煮沸后需更换水洗涤 23 次,以除去残留溶剂。也可用 121灭菌 10min,10min 一到,迅速将蒸汽放出,这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。滤器、接液瓶和垫圈分
7、别用纸包好,在使用前先经 121高压蒸汽灭菌 30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 以无菌操作把滤器装置装好。 过滤: 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘, 将粗糙面向上, 贴放在已灭菌的滤床上, 稳妥地固定好滤器。 将适量的水样注入滤器中,加盖,开动真空泵即可抽滤除菌。,滤膜法,由滤膜上生长的大肠菌群菌落综述和所取过滤水样量,按下式计算1L水中总大肠菌群数:,其他细菌的测定,生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)规定每100mL水不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌。 粪大肠菌群 多管发酵法或滤膜法,培养温度44.5 沙门氏菌属 滤膜法浓缩水样-培养和平板分离-生物化学和血清学鉴定 链球菌 进入水体后,在水中不再自行繁殖。 根据大肠菌群与链球菌菌数的比值不同,可以推测粪便污染的来源,