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1、细胞培养 Cell culture,模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。,体外培养细胞的特性,培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。,原代培养动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长，在传代之前称为原代培养。传代培养细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。,细胞系cell line 原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获
2、无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。细胞株cell strain 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。,常用的细胞,美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等； 其中 ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系，其
3、中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。 ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）。,细胞培养方式,群体培养（mass culture）将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层。 克隆培养（clonal culture）将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。,培养细胞生长的条件,无污染环境:
4、生物安全柜，超净工作台 基质: 玻璃，塑料 营养需要: 氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素 (商业化合成培养基) pH: 7.2-7.4 温度: 细胞培养箱 气体环境O2 CO2,超净台,利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气保持培养箱内空气干净定期消毒（90 ，14 h或者紫外杀菌)。箱内置4-6 L蒸馏水，加入100ml饱和硫酸铜溶液，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发，并抑制真菌污
5、染。,消化液胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
6、人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 激素 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加 10血清。,完全培养基的组成,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位mL,细胞培养基本方法（无菌原则）,无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上。 清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。 操作
7、时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，严格注意无菌操作。,细胞传代方法,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,贴壁生长细胞传代方法,吸光培养瓶中的培养液 加入1-2 ml 0.25胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 加入培养
8、液，终止胰酶消化作用。 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 吸取1/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 将后者放入培养箱中培养。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 细胞冻存与复苏原则：慢冻快融,慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 复苏过程应快融，目的
9、是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,细胞复苏方法,从液氮中取出冷冻管，迅速投入
10、3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 低速离心10分钟。 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞活力测定,台盼蓝法（trypan blue）：利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力,转化,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过
11、的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。,转染,转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。 常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。,瞬时转染和稳定转染,瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但 通常只持续几天。一般来说，在转染后24-96小时内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，-半乳糖苷酶等来帮助检测。 稳定转染，也称永久转
12、染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体 （episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记筛选，如抗生素筛选APH（新霉素抗性基因）， HPH （潮霉素）， TK（胸苷激酶）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。,常用转染技术,脂质体转染： 使用转染试剂，如lipo2000,lipo3000，fugene等）电转：电转仪病毒介导的基因转染 ：如慢病毒，腺病毒等,影响转染效率的因素,细胞本身特性这是最重要因素。 细胞培养物 健康的细胞 低的细胞代数（50）能确保基因型不变 一定的细胞密度 推荐在转染前24小时分细胞
13、，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能 血清 血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。 有些转染技术如脂 质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。,DNA质量 一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果，使DNA质量得到保证。 对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。,
