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1、生物化学与分子生物学,第二十二章 基因结构与功能分析技术,The Analysis Technology for Gene Structure and Function,人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和进行有效的诊断与防治，均需首先揭示基因的结构与功能。 DNA序列测定 基因转录起点及其启动子的分析 基因编码序列的分析 基因拷贝数及其表达产物的分析 基因功能获得和/或缺失策略 随机突变筛选策略,第一节 基因结构分析技术,一、基因一级结构解析技术,基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是DNA测序（DNA sequencin
2、g）。,（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法,Sanger双脱氧测序（dideoxy sequencing）法,Maxam-Gilbert化学降解测序法,（二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理基于Sanger双脱氧法,1. 四色荧光法： 采用四种不同的荧光染料标记同一引物或4种不同的终止底物ddNTP，最终结果均相当于赋予DNA片段4种不同的颜色。因此，一个样品的4个反应产物可在同一个泳道内电泳。 2. 单色荧光法： 采用单一荧光染料标记引物5-端或dNTP，所有产物的5-末端均带上了同一种荧光标记，一个样品的四个反应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳,（三）
3、焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术,焦磷酸测序技术操作简单，结果准确可靠，可应用于单核苷酸多态性位点（SNP）分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点等领域。该方法的测序长度一般短于Sanger法。,（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术,循环芯片测序（cyclic-array sequencing）, 可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本,优势：,技术平台：454测序、Solexa测序（Illumina测序）、SOLiD测序等。,基本流程：, 将基因组DNA随机切割
4、成为小片段DNA； 在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库； 将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面； 对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。 针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。,（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术,主要策略：, 通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序； 直接读取单
5、分子DNA序列信息。,二、基因转录起点分析技术,转录起点（transcription start site，TSS）,（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定TSS,以mRNA为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端加上polyC尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链cDNA克隆于适宜载体，通过对克隆cDNA的5-末端进行测序分析即可确定基因的TSS序列。,该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。但可导致5-末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。,（二）用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS,常用的技术包括5-末端基因表达系列分析（
6、5-end serial analysis of gene expression，5-SAGE）和帽分析基因表达（cap analysis gene expression，CAGE）技术。,（三）用数据库搜索TSS,利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文库5-末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了一次测试可产生1107 个TSS的数据。,三、基因启动子结构分析技术,（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构,该
7、方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以PCR法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。,（二）用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动子结构,1. 用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点,足迹法（footprinting）是利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法。,分类：,酶足迹法 化学足迹法,（1）用核酸酶进行足迹分析,酶足迹法（enzymatic footprinting）是利用DNA酶处理DNA-蛋白质复合物，然后通过电泳分析蛋白质结合序列。 常用的酶有DNA酶I（D
8、Nase I）和核酸外切酶III。,（2）用化学试剂进行足迹分析,化学足迹法（chemical footprinting）是利用能切断DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复合物，由于化学试剂无法接近结合了蛋白质的DNA区域，因此在电泳上形成空白区域的位置就是DNA结合蛋白的结合位点。最常用的化学足迹法是羟自由基足迹法（hydroxyl radical footprinting）。,2. 用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子,电泳迁移率变动分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）只能确定DNA序列中含有核蛋白结合位点，故尚需结合DNA足迹实验和DNA测序等技术来确定具体结合序
9、列。,（三）用生物信息学预测启动子,1. 用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子,在定义启动子或预测分析启动子结构时应包括启动子区域的3个部分 核心启动子（core promoter）； 近端启动子（proximal promoter）：含有几个调控元件的区域，其范围一般涉及TSS上游几百个碱基； 远端启动子（distal promoter）：范围涉及TSS上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。,2. 预测启动子的其他结构特征,启动子区域的其他结构特征包括GC含量、CpG比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。,用于启动子预测的数据库：EPD（eukaryotic promo
10、ter databases）数据库，主要预测真核RNA聚合酶型启动子，数据库中的所有启动子数据信息都经过实验证实；TRRD（transcription regulatory region databases）是一个转录调控区数据库，数据来源于已发表的科学论文。,四、基因编码序列分析技术,（一）用cDNA文库法分析基因编码序列,cDNA克隆测序或构建cDNA文库是最早分析基因编码序列的方法。全长cDNA文库可以通过mRNA的结构特征进行判断，mRNA的序列基本都由3部分组成，即5-UTR、编码序列和3-UTR。 cDNA末端快速扩增（RACE）技术是高效钓取未知基因编码序列的一种方法。 核酸杂交
11、法可从cDNA文库中获得特定基因编码序列的cDNA克隆。,（二）用RNA剪接分析法确定基因编码序列,高通量分析RNA剪接的方法：, 基于DNA芯片的分析法 交联免疫沉淀法 体外报告基因测定法,选择性剪接的转录产物可以通过基因表达序列标签（expression sequence tag, EST）的比较进行鉴定，但这种方法需进行大量的EST序列测定；同时由于大多数EST文库来源于非常有限的组织，故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。,（三）用数据库分析基因编码序列,在基因数据库中，对各种方法所获得的cDNA片段的序列进行同源性比对，通过染色体定位分析、内含子外显子分析、ORF分析及表达谱分析等，可
12、以初步明确基因的编码序列，并可对其编码产物的基本性质进行分析。 利用有限的序列信息即可通过同源性搜索获得全长基因序列，然后，利用NCBI的ORF Finder软件或EMBOSS中的getorf软件进行ORF分析，并根据编码序列和非编码序列的结构特点，便可确定基因的编码序列。,五、基因拷贝数分析技术,分析某种基因的种类及拷贝数，实质上就是对基因进行定性和定量分析，常用的技术包括DNA印迹（Southern印迹）、实时定量PCR技术等。 DNA印迹是根据探针信号出现的位置和次数判断基因的拷贝数 实时定量PCR是通过被扩增基因在数量上的差异推测模板基因拷贝数的异同 DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数
13、的方法,第二节 基因表达产物分析技术,一、通过检测RNA而在转录水平分析基因表达,根据分析方法的原理和功能特性，可将基因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。,封闭性系统研究方法（如DNA芯片、RNA印迹、实时RT-PCR等）的应用范围仅限于已知基因。开放性系统研究方法（如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。,（一）用核酸杂交法检测RNA表达水平,1. 用RNA印迹分析RNA表达,RNA印迹被广泛应用于RNA表达分析，并作为鉴定RNA转录本、分析其大小的标准方法。,2. 用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况,RNA
14、酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是一种基于杂交原理分析RNA的方法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。,3. 用原位杂交进行RNA区域定位,原位杂交（ISH）是通过设计与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理在组织原位检测RNA的技术，其可对细胞或组织中原位表达的RNA进行区域定位，同时也可作为定量分析的补充。,（二）用PCR技术检测RNA表达水平,1. 用逆转录PCR进行RNA的半定量分析,逆转录PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。,2. 用实时定量PCR进行RN
15、A的定量分析,实时定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。,（三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平,1. 基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法,基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于对不同状态下的基因表达谱进行比较，揭示转录组差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。,2. 用循环芯片测序技术分析基因表达谱,运用循环芯片测序技术，可对基因表达谱进行高通量分析，一次可完成几十万到几百万个DNA分子片段的序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。,二、通过检测蛋白质/多肽而在翻
16、译水平分析基因表达,（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽,（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽,酶联免疫吸附实验（ELISA）也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白质/多肽分析方法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体，,（三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达的蛋白质/多肽,免疫组化实验包括免疫组织化学和免疫细胞化学实验，二者原理相同，都是用标记的抗体在组织/细胞原位对目标抗原（目标蛋白质/多肽）进行定性、定量、定位检测。,（四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞,流式细胞术（flow cytometry）通常利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经流式细胞仪分析荧光信号，根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞做出判断。,（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质/多肽表达水平,1. 用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱,根据制作方法和用途不同，可将其分为蛋白质检测和功能芯片两大类。蛋白质检测芯片包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片等，它是将具有高亲和力的特异性探针分子固定在基片上，用以识别生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质蛋白质-DNA蛋白质-RNA，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、蛋白质-小分子等的相互作用。,
