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1、弥散性血管内凝血实验室诊断,华中科技大学同济医学院,弥散性血管内凝血（DIC）是一种在多种较严重疾病基础上发生的临床综合征。以弥散性毛细血管微血栓形成及继发性纤维蛋白溶解亢进为主要病理变化。广泛出血、微循环衰竭及多脏器功能不全为临床特征。,DIC改变几乎涉及到临床每一个专科，严重危及患者的生命。因此近数十年来国内外学者对于本病患者的血管、血小板、凝血及纤溶功能进行了广泛、深入的研究，并在本症的诊断与防治方面取得了较大进展。目前有关DIC诊断的实验室检测甚多，但存在不少问题，如部分特异性强、敏感度高的实验其不能及时提供为临床结果而且价格昂贵，反之则特异性、敏感性较差。,一、DIC常用检测方法(一
2、）,2PT,1血小板计数,3APTT,5D-D,4Fbg,DIC常用检测方法（二）,6. TT,8. AT:A,9. 3P,7. ：C,6. 凝血酶时间（TT）测定,原理 在血浆中加入“标准化”的凝血酶溶液后，血浆凝固所需的时间。材料 0.13mol/L枸橼酸钠溶液；凝血酶溶液；正常血浆；水浴箱、秒表等。操作 血浆0.1ml于试管中、37水浴，加0.1ml “标准化”的凝血酶溶液，计时。连续测定两次或三次取平均值。,注意事项 稀释凝血酶溶液4可保存3天；血浆室温下3h；不宜EDTA和肝素抗凝；终点判断：出现混浊的初期凝固为准。参考值 1618秒，受检者超过对照3秒以上为异常。,临床意义 TT延
3、长多见于肝素增多或类肝素抗凝物质存在，如系统性红斑狼疮、肝病或肾病等；低（无）纤维蛋白原血症，异常纤维蛋白原血症；FDP增多等。 评价 过高、过低Fg可影响结果；过多FDP和类肝素造成TT延长，可用鱼精蛋白或蛇毒时间测定纠正及鉴别；TT可作为临床尿激酶等溶栓及肝素等抗凝治疗的监护指标。,7 血浆因子促凝活性检测,原理 在缺乏因子的血浆中，加入正常血浆或病人的受检血浆，观察APTT的结果值，依据实验室制定的标准曲线，可以计算出病人受检血浆中凝血因子的含量。 材料 乏因子基质、APTT试剂、缓冲液、正常血浆、水浴箱、秒表等。,操作（一期法）将乏因子基质血浆与经过倍比稀释成不同浓度的已知因子含量的标
4、准血浆混合后测定APTT，绘制标准曲线；测定患者血浆同乏因子基质血浆混合后的APTT，通过曲线查结果。注意事项乏因子基质血浆活性30人。,参考值 79%-128% 临床意义 血浆中凝血因子活性增高，主要见于血栓前和血栓状态。减低多见于血友病患者，对于诊断轻型血友病和血管性血友病以及判断血友病携带者有一定的意义。因子:C水平减低也是协助诊断肝病伴发DIC者的重要诊断指标（因子：C活性50%）。,评价 1. 急性期反应中可明显升高； 2. 降低时需与VWF含量测定同时进行； 3. 单纯APTT延长时检测。 4. 受检标本可用缓冲液另行稀释。,8抗凝血酶活性（AT:A）检测,原理 发色底物法在待测血
5、浆中加入过量的凝血酶，凝血酶与血浆中的AT形成1：1的复合物，剩余的凝血酶作用于显色肽，裂解出显色基因对硝基苯胺（PNA），显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆AT：A呈负相关。 材料 缓冲液、凝血酶、发色底物、标准血浆、终止液。,操作 制备标准曲线：稀释标准血浆加入酶标板；同时稀释待测血浆；加入过量凝血酶；混匀，37湿盒30min；加入发色底物，混匀3min后加终止液；酶标仪测定数据。 注意事项 不能用肝素抗凝；标本不能反复冻融，检测前应快速解冻；每次检测均需做标准曲线。 参考值 108.5%5.3。,临床意义 AT水平降低：遗传性AT缺乏是一种常染色体显性遗传性疾病，患者常在手术、创
6、伤、感染、妊娠或产后发生静脉通栓，并可在多处反复发生血栓；获得性AT缺乏分为三个方面：AT合成降低（主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期）；AT丢失增加（见于肾病综合征）； AT消耗增加见于前血栓状态和血栓性疾病，如心绞痛、心肌梗死、脑血管疾病、弥散性血管内凝血、外科手术后等）。AT水平增高：见于血友病A和血友病B、口服抗凝药物、使用黄体酮类药等。,评价AT水平下降是高凝状态较好指标；对疑难DIC具有诊断价值，急性白血病时DIC的危险信号；抗凝治疗中可对肝素治疗进行监测。,9 血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验（3P试验）,原理 在凝血酶作用下，纤维蛋白原释出纤维蛋白肽A、B后，转变为纤维蛋白单体（FM
7、）；纤维蛋白在纤溶酶降解下产生（FDP）。FM与FDP形成可溶性纤维蛋白单体复合物（SPMC）。硫酸鱼精蛋白可使该复合物中FM游离，然后又自行聚合呈肉眼可见的纤维状、絮状，反映FDP尤其碎片X的存在。 材料 10g/L硫酸鱼精蛋白、阳性对照血浆、水浴等。,操作 贫血小板0.5ml于试管中37水浴3min；加硫酸鱼精蛋白溶液0.05ml混匀，3715min，立即观察结果。 注意事项 1.本试验需用枸橼酸钠抗凝，不能用草酸盐、肝素或EDTA盐等做抗凝剂。 2.抽血不顺利、抗凝不完全、标本保存于冰箱、到时未立即观察结果等，均会导致假阴性结果。 3.若水浴温度太低或纤维蛋白原的含量过低，都会造成假阴性
8、结果。,参考值 正常人3P试验阴性。 临床意义 阳性见于DIC的早期或中期；但本试验假阳性常见于大出血（创伤、手术、咯血、呕血）和样品置冰箱后测定等。阴性见于正常人、DIC晚期和原发性纤溶症。如用连续稀释硫酸鱼精蛋白副凝固试验（SDPST），其结果较3P试验敏感。 评价 方法简便，灵敏度较高，费用低，为早年临床诊断DIC常用的确诊试验之一；但由于Fg含量过低易导致3P假阴性等因素，目前可以D二聚体代替。,二、分子标志物的检测及在DIC诊断中的意义,血栓与止血分子标志物检测方法近10余年来发展很快，其内容与方法颇多，且具有特异性强、敏感性高的特点，在研究血栓与止血性疾病与临床各类疾病特别是临床各
9、类疾病引起的DIC或前DIC(Pre-DIC)状态的发病机制，诊断和防治方面有重要价值，现将较为常用的方法介绍如下：,（一）内皮细胞受损标志物检测,1、内皮素(ET-1)检测： 临床意义：内皮素是迄今为止最强的收缩血管物质， 其在血浆中水平增高，反映血管内皮损伤。 正常参考值：50.87.58pg/ml (放射免疫法) 2、凝血酶调节蛋白（TM）测定： 临床意义：TM是血管损伤的分子标志物。资料显示：90以上DIC患者TM升高。 正常参考值：2035g/L(放射免疫法)。,（二）血小板激活分子标志物检测,1、 血小板颗粒释放物质的测定 临床意义：血小板-TG及PF4活性增高主要见于各类引起血小
10、板过度激活及消耗性疾病如DIC时。 正常参考值： -TG 25.33g/L， PF4 3.20.8g/L 2、 血小板膜及血浆血小板-颗粒膜蛋白测定 临床意义：DIC时由于体内凝血酶大量形成，激活血小板使血浆中GMP140明显增高。 正常参考值：GMP140 1.610.72X1010分子数/ml。,（三）凝血活化分子标志物检测,1、凝血酶原片段1+2(F1+2)检测： 临床意义： F1+2是凝血酶原转变为凝血酶过程中释放出的片段，可反映凝血酶原酶及凝血酶活性，是因子的分子标志物，其增高多见于血栓前状态和2550%易栓症患者。 正常参考值：0.670.9nmol/L（ELISA法）,2、纤维蛋
11、白肽A（FPA）检测： 临床意义： FPA可以敏感地表明血液中有凝血酶生成。华科大同济医学院报道52例DIC患者尿FPA明显高于正常组(120.464.3ng/mg:Cr)。正常血浆参考值：1.20.8g/L正常尿液参考值：25.410.3ng/mg。 3、可溶性纤维蛋白单体复合物（SFMC）测定： 临床意义：有报道该检查在前DIC状态，阳性诊断率为87%，敏感性为91%，特异性为83%。参考值ELISA法：48.515.6g/L；凝集法： 阴性。,4、凝血酶-抗凝血酶复合物测定（TAT）：临床意义：可敏感反映凝血酶的生成，增高多见于AMI、不稳定性心绞痛、妊高征等疾病以及DIC。 正常参考值
12、：1.04.5g/ml（ ELISA法 ）。5、 组织因子（发色底物法）检测： 临床意义： 凝血过程的主要启动因子，约有63.6%的DIC病例TF抗原和活性增高。 正常参考值： 97.7%16.7（发色底物法） 30220ng/L （ELISA法）,（四）抗凝和纤溶活化分子标志物检测,1、 蛋白C（PC）测定 临床意义：先天性PC缺陷患者表现为反复原因不明的血栓形成；PC:Ag及其活性增加多见于冠心病、糖尿病、肾病综合征、妊娠后期等情况。 正常参考值： （1）抗原（PC:Ag）测定 电泳法为102.520.1%，放免法为3.10.5g/ml。 （2）活性测定 发色底物法参考值(64147)%。
13、,2、 组织因子抑制物（TFPI）检测 临床意义：有报道Pre-DIC状态患者TF增高，TFPI水平正常，TF/TFPI比率增高。 正常参考值：6080ug/L（ ELISA法）3、 D二聚体测定 临床意义：9098%DIC患者D二聚体增高；是纤维蛋白降解产物中的聚合物，在原发性纤溶症为纤维蛋白原降解故呈阴性。 正常参考值：乳胶法为阴性(小于0.5mg/L)；ELISA法：0.5mg/L,三、DIC简易判断标准,1. Plt、PT、Fbg。 2. TT、D-D、3P。 上述1三项或两项加2一项结合临床可考虑诊断。,四、DIC一般诊断标准（全国第六届血栓与止血会议1999）,1、存在易致DIC的
14、基础疾病：如感染、恶性肿瘤、病理产科、大型手术及创伤等。 2、有下列二项以上临床表现：a严重或多发性出血。b不能用原发病解释的微循环障碍或休克。c广泛性皮肤、粘膜栓塞、灶性缺血性坏死、脱落及溃疡形成，或不明原因的肺、肾、脑等脏器功能衰竭。d抗凝治疗有效。,3、实验检查符合下列条件 （1）同时有下列三项以上实验异常：a. 血小板计数进行性下降 100109/L（白血病、肝病20mg/L（肝病60mg/L）或血浆DD水平较正常增高4倍以上（阳性）。d. PT延长或缩短3秒以上（肝病 5秒），APTT延长10秒以上或缩短5秒以上。,e. AT-活性80pg/ml或凝血酶调节蛋白（TM）较正常增高二倍以上。,（2）疑难或特殊病例有下列二项以上异常：,a血浆凝血酶原碎片1+2（F1+2）、凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）或纤维蛋白肽A（FPA）水平增高。 b. 血浆可溶性纤维蛋白单体复合物（SFMC）水平增高。 c. 血浆纤溶酶纤溶酶抑制物复合物（PIC）水平增高。 d. 血浆组织因子（TF）水平增高（阳性）或组织因子途径抑制物（TFPI）水平下降。,
