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1、流式细胞仪 FLOW CYTOMETER,原理及应用A,EPICS XL 流式细胞分析仪,流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展、综合的结晶。FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究,流式细胞术,流式细胞仪与显微镜,FLOW MICROSCOPE,光源,激光,自然光、灯光、氙(汞)灯,对象,细胞、生物粒子,细胞、生物粒子,承载工具,载(盖)玻片,鞘液及流动室,检测信号,光学信号,形态及染色,放大方式,PMT，放大电路,目镜X物镜,统计,人工，200,计算机，5000,结果,简单，单参数,多参数，综合分
2、析,基本原理,流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路 光源 滤片 光电倍增管PMT HV电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换统计：计算机,流 路,单细胞悬液大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦,FLOW CELL,光 路,光源检测信号散射光信号FS: 前向角散射光SS: 侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片,光 路,光源与通过的细胞聚焦在同一点上 激光空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空
3、冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列,检测信号,散射光信号前向散射光(FS),FS-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小,前向散射光,前向散射光,散射光信号 侧向散射光,SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optica
4、l homogeneity 有关SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少, 核质比,侧向散射光,侧向散射光,90 Degree Scatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200,1000,Lymphocytes,Monocytes,Neutrophils,Side Scatter Projection,Light Scatter Gating,Scale,光路-荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,荧光染料的特
5、性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION),常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670,常用荧光染料(488nm,633nm激发),Fluorescein Isothiocyanate (FITC) Phycoerythrin (PE) Allophycocyanin (APC) Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP) Tandem Dyes PE-Texas Red (ECD) PE-Cy5 (PC5) PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures) PE-Cy7 (PC7) (futures),
