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1、第一章 柠檬酸发酵工艺学,三、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法,1、斜面低温保藏法 2、载体吸附保藏法 3、真空冷冻干燥保藏法 4、液氮超低温（-196）保藏法,是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 黑曲霉在pH为23的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很低。,2.1 概述 2.2 黑曲霉柠檬酸生产菌的选育及保藏 2.3 柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺 2.4 柠檬酸的提取和精制 2.5 柠檬酸的质量标准及新工艺新技术,2.3 柠檬酸发酵机制 及深层发酵工艺条件,第
2、一节 柠檬酸发酵机制,一、柠檬酸生物合成途径 1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径 葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。,糖酵解途径 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 6-磷酸果糖 1,6-二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮+3-磷酸甘油醛 磷酸二羟丙酮 3-磷酸甘油醛 1,3-二磷酸甘油酸 3-磷酸甘油酸+ATP 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸+ATP激酶凡是催化磷酰基键ATP分子转移到受体上的酶，都称为激酶,HMP途径 6-磷酸葡萄糖 5-磷酸核酮糖 5-磷酸核糖+5-磷酸木酮
3、糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛 磷酸-D-赤藓糖+5-磷酸木酮糖 6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛,EMP途径在黑曲霉柠檬酸生产菌中起重要作用。 研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶系，证明黑曲霉中存在三羧酸循环。 研究证实，CO2固定反应对柠檬酸积累具有重要的生理意义。 黑曲霉CO2固定中，存在两个CO2固定系统 丙酮酸草酰乙酸Keq=0.818 磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸，Keq=0.049 可见，黑曲霉柠檬酸生产菌中CO2固定反应主要是丙酮酸羧化酶催化的，黑曲霉中已提纯出此酶。,柠檬酸生物合成途径,三羧酸循环概要,2、酵母柠檬酸生物合成途径 解脂假丝酵母能利用烷烃、乙醇、乙酸发酵生成柠檬酸。,
4、酵母（烷烃）柠檬酸生物合成途径,异柠檬酸裂解酶切割异柠檬酸 产生乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸经苹果酸合成酶催化， 在水的存在下接受乙酰辅酶A的乙酸， 生成苹果酸。,NAD+ :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化态） NADH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原态） NADP+ :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化态） NADPH :烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原态） NAD+ + H+ + 2e- = NADH NADP+ + H+ + 2e- = NADPH 辅酶，用来实现电子传递,二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢控制,1、黑曲霉柠檬酸积累的代谢调节 第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK酶）柠檬酸、ATP对该酶有抑制作用：
5、 生产菌需要解除该抑制AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用 实验表明，NH4+能有效的解除柠檬酸、ATP对该酶的抑制作用 因此，生产上添加铵盐来增加柠檬酸产量Mn2+的影响： Mn2+缺乏菌体TCA酶活下降 Mn2+缺乏可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解减少柠檬酸对该酶的抑制NH4+水平升高,第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应 研究证实，柠檬酸的生成速度与CO2固定量有化学计量关系， CO2固定主要是丙酮酸羧化酶催化的，生成了草酰乙酸。 第三个调节点：TCA环上的调节 柠檬酸合成酶，是一种调节酶，但在黑曲霉中没有调节作用 顺乌头酸水合酶、异柠檬酸酶 pH2.0时，失活
6、阻断TCA循环 柠檬酸合成酶活性很高时积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+在发酵液中添加黄血盐，络合Fe2+阻断TCA循环，积累柠檬酸黑曲霉除正常呼吸链（产生ATP）之外，还存在一条侧呼吸链（不产生ATP）缺氧对侧呼吸链的损伤是不可逆的，因才在产酸阶段，一定要保证足够的溶氧供应。,三、 黑曲霉柠檬酸的发酵机制归纳,由于严格限制供给锰离子，筛选出耐高浓度金属离子的菌株，使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大。存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，不产生ATP，缺氧则呼吸链失活，细胞内ATP浓度下降，减轻了ATP对PFK酶的抑制，促使EMP途径的
7、畅通，增加柠檬酸的生物合成。丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和草酰乙酸的供给，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力。,-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使-酮戊二酸浓度升高，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬酸分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的
8、活力，从而进一步促使柠檬酸的自身积累，pH降至2.0以下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累并排出体外。,柠檬酸食用小贴士常饮酸牛奶：酸奶中含有的乳酸及其它一些有机酸如柠檬酸、葡配合酸等，其稀释液还具有明显的杀菌和防腐作用，被誉为粘膜组织的“清洗剂”，它有助于软化皮肤的粘性表层，去掉死去的旧细胞，在此过程中，皱纹也随之消除了。 吃水果减肥，是不少女性最喜欢使用的方法之一。每100克柠檬中只含24卡路里热量。柠檬中的柠檬酸能促进热量代谢，而且它的维生素C含量是水果中的佼佼者，美白效果好，热量又低，爱美想瘦的女性可适量食用，但避免空腹吃。其它如荔枝，桔子，葡萄等都是富含柠檬酸
9、的佳品。 白癫风患者不能服用含柠檬酸一类的酸的东西。,第二节 柠檬酸发酵原料 工业上考虑因素：经济、技术、货源、易得、易运、易贮、易管、不易霉变、可利用物质含量高、综合利用价值高、无毒、无害、无抑制微生物生长的物质、对产品卫生安全可靠、三废负荷少。 1、糖类薯类：甘薯、木薯、马铃薯、甘薯干、木薯干、马铃薯干、薯渣谷类：玉米、小麦或小麦面粉、大米淀粉：各种谷类、薯类等加工成的淀粉砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜淀粉糖：由淀粉水解得到的各种单糖、双糖、糊精、饴糖、葡萄糖母液,2、正烷烃液体石蜡：1020碳链的石油馏出物 3、其他果实下脚料：葡萄、菠萝、柑橘、苹果等果实加工的残渣、残汁粮食加工下脚料,第三
10、节 柠檬酸深层发酵工艺,为延长黑曲霉作用时间，采用二次发酵工艺 第一次固体发酵培养基接种黑曲霉（30静止培养3d）第一次发酵 加适量麸皮、尿素及等量酱渣接种白地霉、酵母菌（30静止培养）第二次发酵。,柠檬酸深层发酵工艺流程,深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。现多采用通用发酵罐。 它的主要部件： 罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。 发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。,培养基制备： （1）种子罐培养基及培养：甘薯干粉1620%，(NH4)2SO40.5%，0.1MPa蒸汽灭菌30min，接入1
11、000ml三角瓶麸曲菌种，351培养1624小时，发酵罐的接种量为10%。 （2）发酵培养基：甘薯干粉1620%，0.1%中温-淀粉酶115灭菌1015min，玉米粉采用高温-淀粉酶二次喷射液化，液化后过滤除渣，应控制并调配其发酵培养基中蛋白质含量为0.20.4%,一、营养要求 根据柠檬酸发酵机制，黑曲霉能够大量积累柠檬酸的条件，提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对磷、锰、铁、锌等无机盐物质处于低水平。 1、碳源：葡萄糖、蔗糖、糊精为了降低成本，工业上：甘薯、玉米、小麦及其淀粉、糖蜜等。 高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征：薯干粉的深层发酵，粉浆浓度16%20%，淀粉质深层发酵，粉浆浓度达25%2、氮
12、源（合成细胞质和调节代谢） 生理酸性氮 (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl, (NH4)2CO3等，调节代谢，控制pH 生理碱性氮 NaNO3, KNO3, LiNO3, Ca(NO3)2, Mg(NO3)2等 两性氮 NH4NO3 有机氮 麸皮，米糠，蛋白胨，氨基酸，尿素等,玉米原料特点,1、玉米淀粉,2、玉米蛋白质,玉米粉的蛋白质含量较高，达9.3%，属于醇溶朊、谷朊、球朊等。其中醇溶朊是玉米蛋白质的主要成分，它占玉米蛋白质总量的40%，加热后凝固。玉米蛋白质对柠檬酸发酵具有双重作用：一是节省柠檬酸发酵所需氮源；二是与戊聚糖、色素等胶体杂质一起影
13、响后道发酵及提取收率。因此，原料预处理过程中通过中和、过滤去除这部分杂质对柠檬酸生产的后道发酵、提取是必要的。,3、玉米中脂肪,3、无机盐 在柠檬酸发酵中，无机盐有的构成菌体，有的促进代谢，有的促进产酸，对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵有重要作用,二、温度控制 黑曲霉属嗜热微生物，最适生长温度3337 37 菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸 一般控制在（351） 孢子发芽和菌球体形成阶段，可采用40 高温培养，促进其发育 三、pH控制 适宜pH37。在发酵过程中，原料糖化和产酸过程在同一个环境中，发酵技术的关键是要保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。 黑曲霉
14、柠檬酸生产菌的酸性糖化酶最适pH4.04.6 柠檬酸发酵最适pH2.0以下 解决办法：采用酸性平板驯化，分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高的菌株；通过调节风量来控制，在1618h前控制低风量，使pH维持在有利于菌株生长和糖化作用的范围。,1、最适温度的选择 在生长阶段，应选择最适生长温度； 在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。 发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择 2、温度的控制 工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。 利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层，通过热交换来降温，保持恒温发酵。 如果气温较高（特别是
15、我国南方的夏季气温），冷却水的温度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，就可采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证在正常温度下进行发酵。,二、 发酵温度为351,三、pH值控制,（1）pH值对发酵的影响 影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢； 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生物对这些成分的吸收； pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。,（2）发酵过程pH值的变化 在发酵
16、过程中，随着菌种对培养基 碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基酸的积累，会使pH值产生一定的变化。 生长阶段：菌体产生蛋白酶,水解培养基中的蛋白质，生成NH4+，使pH上升至碱性；随着菌体量增多， NH4+的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。 生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。 自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体趋于自溶而代谢活动终止，菌体内活跃的蛋白酶和氨基氮进入培养液中，致使pH又上升。,pH值,培养时间,培养过程中培养液pH值的大致变化趋势,由此可见，在适合于菌生长及合成产物的环境条件下，菌体本身具有一定的调节pH的能力，但是当外界条件变化过于剧烈，菌体就失去了调节能力，培养液的pH就会波动。,（3）引起发酵液pH值异常波动的因素 pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件 A)、pH下降： 培养基中碳、氮比例不当。碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加上溶氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降； 消泡剂加得过多； 生理酸性物质的存在，铵被利用，pH下降。 B)、pH上升： 培养基中碳、氮比例不当。氮源过多，氨基氮释放，使pH上升； 生理碱性物质存在； 中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多。,
