第四章 生物制品生

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1、第四章 生物制品生产基本技术,第一节 菌种与毒种选育技术,一、生物制品毒种的标准 生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。 遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。 免疫抗原、反应抗原好：高质量疫苗的基础。 毒力在适当范围内：灭活疫苗应该是强毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。测定毒力要用敏感动物进行。,二、强毒种的选育 1、强毒种的用途：灭活疫苗、诊断试剂、抗血清、攻毒试验。 2、强毒种来源：典型传染病分离培养;保藏中心提供。 3、强毒种分离：,a、纯粹试验（分离培养、鉴定）。 B、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。

2、 C、抗原性（免疫及反应抗原试验） D、稳定性（传代不变异） 达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准,复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的（日本731部队用人试验，目的是增强细菌毒力，做细菌武器使用。）。,三、弱毒种的选育 1、用途：弱毒疫苗，诊断试剂，免疫血清。 2、来源：自然界筛选和人工诱变。 3、弱毒筛选途径：,自然界弱毒筛选：同源弱毒新城疫I系异源弱毒火鸡疱疹病毒疫苗，它们都是在自然界寻找发现的。 人工诱变筛选：化学诱变：洗衣粉、锥黄素、醋酸铊等加入培养基。物理诱变：高温培养，干燥，紫外线等。生物诱变：通过钝感动物，细胞以及细

3、胞培养获得。,4、初选的依据： 生物性状改变猪丹毒杆菌变长丝状，菌落光滑变粗糙。 病毒蚀斑变异。 温度敏感变异。 药物敏感变异 营养变异 宿主变异,第三节 细菌培养技术,细菌培养技术是生物制品制造的基础，一些内容在微生物学已经学习过，这里主要讲一些重要的细菌培养技术。,一、细菌生长规律与条件,大家一定要熟悉细菌的生长曲线，因为不同的生物制品，要用不同时期的细菌，如细菌疫苗，要对数期或稳定期细菌；芽孢疫苗，要衰老期细菌；外毒素要老龄细菌。,其次，要根据不同细菌用不同的培养基进行培养，用不同的培养方法（需要氧气，微需氧，厌氧。另培养温度，pH，渗透压等。）。,二、细菌培养的基本技术,步骤：先分离出

4、单个菌落斜面培养基生化或血清鉴定菌种保存生产生物制品先接种到斜面菌种小三角瓶肉汤大三角瓶肉汤。,（一）细菌分离培养（目的是稀释病料，得到单个典型菌落）。 1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。 2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。,厌氧罐,厌氧培养箱,（二）细菌的规模培养 生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。 1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。 2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外毒素

5、：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。,液体静止培养：一般细菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。,3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。 固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。 培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液

6、。,液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和污染。 透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和毒素含量。 连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。,KRH-PB-6L 玻璃发酵罐,（三）细菌计数技术,细菌疫苗必须有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，应该对生产的疫苗计算含菌量。 1、直接显微镜检查计数 定量定面积染色计数：10ul菌液，涂抹1cm2面积的载玻片上，干燥固定染色，油镜下观察，油镜直径是0、16mm，视野面积是0、02mm2，1cm2面积有50万个油镜视野，多观察几个视野，算出一个视野细菌平均数X50万X100，即每ml含

7、细菌量。,比例法计数（也叫对照法） 如用已知人红细胞为500万/mm3（可以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌液与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/ mm3，1ml是500000万个细菌。,估计计数法 接种环直径在0、5cm，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，大约0、51 cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是19个细菌，菌液含量是105-6个/ml，1099为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。,红细胞计数室法：

8、 （细菌量）Y/80X400X稀释倍数X10=细菌数/ mm3，变ml乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。,2、比浊比色法,比浊管法 含菌量与浑浊度正比，用已知菌含量的试管与标准比浊管相比，找出规律，如1亿细菌=1号比浊管颜色，10亿等10号，以后，用未知细菌液与标准管比色，得出大致细菌含量。,美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为

9、4002000万；2-5、5小时为50400万；5、5小时以上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。,3、活菌计数：,原理，一个菌落是一个细菌的后代，数菌落就知道含菌量，也叫菌落形成单位CFU：colony format unite。 倾注法（GB方法）：菌液10倍递减稀释，选2-3个稀释度，各取1ml于平皿，加45-50营养琼脂15-20ml，摇匀37度培养，计算菌落，乘稀释倍数，即每ml细菌数。,平板表面涂布法：先做好营养琼脂平板，将不同稀释度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮匀，37度24h培养，计算菌落乘稀释度乘10=菌数/ml 微量滴板法：将不同稀释度菌

10、液，各取0、02ml滴在营养琼脂板上，一板可以滴多点，自然扩散，37度培养，计算每点菌落乘50乘稀释度=菌数/ml。,三、培养基,微生物学已经学过，自己温习，重点熟悉： 不同微生物用不同的培养基来培养 注意各种营养物质浓度配比 调节合适的pH范围,第三节 病毒的增殖技术,一、病毒的复制与培养 病毒为专性细胞寄生物，必须在活细胞内生存，其复制过程是：吸附，进入，脱壳，生物合成，装配和释放。微生物已经讲，自己复习。二、病毒的动物接种增殖 （一）、病毒材料的处理1、病毒的释放：剪碎研磨， 1：5-10稀释，冰冻融及超声波处理。2、除杂菌：细菌过滤器过滤，高速离心取上清液；其次是抗生素处理，加5001

11、000u/ml青霉素和链霉素，4度过夜杀菌。,（二）动物选择 健康动物、SPF动物； 未接种相应病毒疫苗动物 适宜年龄和体重 易感动物。 （三）接种方法：皮下，肌肉，静脉，腹腔，脑，胸腔等,三、鸡胚的接种,（一）鸡胚的选择 1、健康的SPF鸡胚 2、白壳，薄壳消毒蛋 3、没免疫相应病毒疫苗 4、5-7天照蛋，去无精、死胚鸡蛋 5、画出气室，接种24h照蛋，定时收病毒。,（二）鸡胚的接种和收获 避开血管和心脏，确定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱针或12号针头钻孔，然后可以接种。预先准备好病料，注射器，融化的石蜡。 1、卵黄囊接种：用5-8天鸡胚，在气室中心，胚胎对侧刺入3cm（先用三棱

12、针钻孔）。用于病毒，立克次氏体，衣原体接种。 2、尿囊腔接种，用9-11日鸡胚，在气室边缘下2cm，避开血管，40进针0、5-1、5cm。适应鸡新城疫，鸭肝炎，鸡传染支气管炎病毒接种。,3、羊膜腔接种：用10-12日鸡胚，在胚胎对侧进针，有抵抗时注入病毒。 4、绒毛尿囊膜接种：选1113日鸡胚，先造人工气室，然后在人工气室内注射，适合痘病毒，疱疹病毒等。 另外，还有脑，胚体，静脉接种，难度大，科研使用。 不同病毒用不同接种途径，培养时间不同，收获组织也不同。,（三）影响禽胚增殖病毒的因素,1、种蛋质量：要用SPF蛋，母源抗体存在，抗生素（对立克次氏体和衣原体）。2、孵化环境：温度是37、8-3

13、8，湿度53-57%，通风，定时翻蛋。3、接种技术：无菌操作和消毒，收获根据不同病毒，收获病毒时间不同，不要臭蛋和浑浊蛋。收获后测效价，加双抗-20保存。,四、细胞增殖病毒技术,1、细胞培养概念：利用机械、酶、化学方法使组织或单层细胞分散成单个或2-4个细胞的悬液，进行培养。 原代细胞：新鲜组织制备的单细胞进行培养，一般仅可以传代3代。 二倍体细胞：自继代细胞选出的也特殊生物学标志的细胞，染色体是二倍体，可传代50-100代，主要做疫苗生产。 传代细胞：非二倍体，多为癌细胞，可无限生长，如Hela细胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生产。,2、细胞培养的方法 静止培养：细胞悬液接入培养瓶中，密封置

14、温箱培养，细胞沿瓶子壁长成单层，为最简单培养病毒方法。 转瓶培养：细胞悬液在转瓶旋转培养，10-20转/h，细胞贴壁生长，需要营养液少。 悬浮培养：通过震荡，转动使细胞悬浮于液体中培养。 微载体培养：以固体小颗粒为载体，便于细胞附着，载体扩大了表面积。 中空纤维培养：细胞在中空纤维内生长。 微囊化培养：细胞在微囊中生长。,3、细胞的制备 细胞间有胶原蛋白，要破坏它们才变成分散单细胞。 机械分散：将组织剪碎成1mm3小块，再挤压通过铜丝网孔，可得到单细胞。 酶消化法：常用胰酶破坏细胞间质，活力1：250，浓度是0、25%，pH7、4-7、6。 鳌合剂分散法：EDTA可除去维护细胞间结合的Ga+和

15、Mg+，常用于单层细胞的分散。,4、细胞培养的要素 营养物资：培养液（含氨基酸，犊牛血清，维生素，盐，糖等成分）。现多用成品细胞培养基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。 接种量：与单细胞生长成正比，量过大，因细胞碎片产生毒性作用，过小，不易长成单层。不同细胞有不同接种量，如鼠肾细胞50万/ml，鸡成纤维细胞2040万ml，猪肾细胞80万/ml，血球计数室计数。,pH、温度、气体环境：pH7、2-7、4，不低于6、8，不高于7、6；温度一般是37，过高容易死亡，过低生长慢，20-25，细胞缓慢长。气体环境，一是橡皮塞密封培养；二是CO2培养箱培养。,5、污染问题： 细菌、真菌、支原

16、体污染，加一定量抗生素可杀菌，如加青链霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。 病毒污染：有组织代毒和培养带毒，前者用SPF动物组织可以解决，后者注意灭菌和消毒。胶原虫：（存在犊牛血清），血清37培养1个月以上，高速离心，检查沉淀物。,6、病毒增殖技术 选敏感动物细胞。 注意营养，温度和pH。 接种量和方法：1-10%接种，V/V；分同步和异步接种。 支原体污染，加抗生素。 细胞病变：CPE，有圆缩、聚合、合胞体、包涵体，轻微病变，以及无细胞病变。 收获：CPE到80%收获，反复冻融，离心取上清夜，测效价，加双抗，-20保存。,第四节 疫苗制造流程,制造优良疫苗的关键： a、优良的菌种 b、适宜的培养方法； c、良好生产工艺； d、严格的检验和标准。,一、细菌灭活疫苗制造 1、种子：毒力强，免疫原性好，13个菌株，菌种逐级扩大培养。 2、培养：选适当培养基和方法，如固体或液体培养，要计数活菌和观察纯度。 3、灭活和无菌检查：加适量甲醛37度灭活24h，接种斜面培养基无菌检查， 4、浓缩提高含菌量：离心或沉淀方法。 5、配佐剂分装：加20%铝胶，或油2：1水油乳化，无菌分装，加塞，封蜡，标签和装箱。 6、动物安全试验，接种小白鼠0、2ml观察3天，健活。,