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1、动物细胞培养的方法 之 细胞冷冻保存技术,细胞的低温保存,细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。 目前，动物细胞一般保存于液氮中（-196）。,一般在原代或传代210次内即大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老 。,根据细胞冷冻液在在冻结后是否形成冰晶，低温 冷冻保存细胞可分为：1非玻璃化冷冻细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水形成冰晶。2玻璃化冷冻细胞在冷冻过程中，细胞内和细胞外的水不形成冰 晶，而是形成玻璃态。,非玻璃化冷冻,原则
2、：缓慢冷冻原因：当温度降低到冰点以下时，细胞内外的水分就会形成冰晶。细胞内形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的损伤。这种损伤称为细胞内冰晶损伤。细胞外的水形成冰晶后，使得未结冰的溶液中的电解质的浓度升高，细胞在这种高浓度的溶质中时间过长，会使细胞膜上的脂质受到损害，细胞膜破裂，这种损害称之为溶质损伤。,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。,在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。 原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点 2.提
3、高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。3.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。,解决办法：冷冻保护剂的应用,在培养液中添加的保护剂：,二甲亚砜（Dimeethylsulfoide,DMSO）， 甘油,可使细胞免受低温冰晶形成、及渗透压改变而导致的物理损伤。预先配制冻存保护液： 含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形
4、成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,冻存培养细胞,(1)预保留细胞经消化分散后，用将其预冷却，4度取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1- 5 106细胞/ml)； 冷冻保护剂降温时减少细胞内冰晶分子的形成，以免对细胞造成伤害。,(2)加入1ml细胞悬液于冻存管中，在火焰下将安瓿封口。密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。可用带有18G针头注射器进行分装，如剂量过大，保护剂对细胞渗透作用不匀，冷冻效果不好。(3)加保护
5、剂的细胞悬液经缓慢冷冻，结冰产生在细胞外(对细胞没有损伤)。如果要长期保存，可以使用液氮罐，,(4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。温度达-150-190 ，细胞几乎处在停止状态。冷冻时带手套操作，以免冻伤。,慢冻程序,标准程序：当温度在-25以上时， 12/min当温度达-25以下时， 510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮中,缓慢冷冻的简化程序,配置冷冻保护液,在培养液中加入 血清（一般20%） 10% 甘油或 DMSO,将冷冻液加入离心管，使 细胞浓度为 26106cell/ml,将冷冻液分装到冷冻管中,4冰箱放置30-60min-20 冰箱放置2小时,（冷冻管放入泡沫盒或
6、用棉花纱布包裹）-70冰箱放置1-2天,投入液氮罐,取旺盛生长的细胞,消化后用离心管离心回收细胞,在没有程序控制冻存器设备的条件下,将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速 度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,-196液氮罐,普通冰箱,低温冰箱,解冻程序,原则：快速解冻原因：解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为 中 心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采 用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。解冻程序：从液氮中取出冷冻管，快速放入37- 40水浴中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40
7、-60s).,玻璃化冷冻,原则：快速冷冻原因：从理论上讲，只要获得足够快的降温速度，任何液体都可以进入玻璃化状态。例如：要是纯水进入玻璃化状态，降温速度需高达 1010 /s，以现在的条件没办法达到。,解决办法：通过添加高浓度的冷冻保护剂，可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速度。一般冷冻保护剂的浓度为40%-60%。 冷冻保护剂：DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇等。,玻璃化冷冻的程序,配置冷冻液,在平衡盐溶液（Hanks）中加20.5%DMSO(w/v) 15.5%乙酰胺(w/v ) 、10%丙二醇和10%聚乙二醇。（以单核细胞为例）,取旺盛生长的细胞，消化后用离心管离心回收细胞，并将离心管
8、置于冰浴中,将预冷的冷冻液缓慢地滴加到离心管中，使细胞浓度为1-1.5106cell/ml。 （滴加的速度先慢后快，具体过程如下:前3分钟以0.3ml/min滴加；后5分钟以0.6ml/min滴加；余下的以0.75ml/min滴加）,将含有细胞的冷冻液分装到冷冻管中,将冷冻管投入液氮,-196液氮罐,解冻程序,从液氮中取出冷冻管放入冰浴中5min，使其融冻,转移到离心管，并放入冰浴中,将已在冰浴中预冷的含20%血清的Hanks液对细胞冻存悬液稀释。 （稀释过程要缓慢，具体过程如下：前10分钟0.2ml/min速度滴加；接下来10分钟以0.5ml滴加；接下来的15分钟以0.75ml/min滴加；最后30min以1ml/min滴加）,离心回收细胞，弃上清，加入培养液培养细胞,步骤,从液氮取出冻存细胞，立即投入盛有38摄氏度温水的容器内，摇动冻存管，使其内容物在20-60秒内完全溶化成悬液。无菌下打开冻存管，接种于培养瓶中,加入新鲜培养液，37摄氏度孵箱培养24小时更换培养液去除冻存液，继续培养。,
