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1、第四节：蛋白质的重要性质及分离纯化,Release proteins from cells and Differential centrifugation as a first step in protein purification,蛋白质与aa一样，能够发生两性解离，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。等电点测定 等电聚焦法（isoelectricfocusing）,一、蛋白质的性质,（1）蛋白质的两性解离,蛋白质的分子量很大（1-100nm），在水溶液中具有胶体性质，如布郎运动、丁达尔现象不能通过半透膜等。 透析：将含小
2、分子杂质的蛋白质放入透析袋，置水中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。 半透膜：只允许小分子通过，而大分子不能通过。如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。,（2）蛋白质的胶体性质,稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：A.蛋白质表面极性基团形成水化膜。B.非等电状态时，同种电荷的互相排斥。蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。,（3）蛋白质的沉淀作用,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从溶液中沉淀分离, 沉淀过程中，蛋白质结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶
3、解形成溶液，故这种沉淀又称为非变性沉淀或可逆沉淀。 可逆沉淀的方法:等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀或不可逆沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,（4）蛋白质的变性,a.蛋白质的变性,蛋白质变性后的现象： 结晶及生物活性丧失。 疏水侧链基团外露，分子结构
4、伸展松散。 理化性质改变，溶解度降低，沉淀，粘度增加。 生物化学性质改变，易被蛋白酶水解。,b.引起蛋白质变性的主要因素：,温度（热、冷） 强酸、强碱 尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）H2N-C-NH2 H2N-C-NH2+Cl- 表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDS）CH3-（CH2）10-CH2-O-S-O-.Na+ （1.4gSDS/1g蛋白）,O,NH2,o,o,c.蛋白质的复性,当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。,Trp、Tyr和Phe在280nm 附近有最大吸收。因此，利用这个性质，可以对
5、蛋白质进行定性鉴定和定量测定。,（5）蛋白质的紫外吸收,二、分离纯化蛋白质的主要方法,（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法 等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法,（二）、根据 分子大小和形状的差异分离,透析和超滤法：除去小分子物质,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。,施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子,沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析,密度梯度离心法,凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（Sephadex
6、）;聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-Gel P ，）琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）,凝胶过滤法,（三） 根据电荷性质的差异分离1、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 装置：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 支持物： PAGE 、琼脂糖胶等）,Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE),Molecules are separated by size and charge in an electric field.,Isoelectric Focusing relies on the migrati
7、on of charged proteins in an electric field,等电聚焦法,2、离子交换层析法基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂,电荷基团：,（四） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析亲和层析:利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力。 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。,（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography),HPLC的特点： 1.支持介质颗粒细，比表面积大。 2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。 HPLC是一项快速、灵敏、高效的分离技术。,
