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1、第十章 基因定位和基因结构研究,通过基因克隆操作，我们可得到包含目的基因的DNA-分子；将这些DNA-分子重组到相应的载体上，可获得含有目的基因的重组载体；重组载体转化细菌或噬菌体后经过培养扩繁，可扩增到大量目的基因的DNA-分子，用于该基因的相关研究。 过去十几年中，发展了许多克隆基因的方法，从本章开始我们把注意力转移到利用克隆、PCR和DNA分析技术等研究基因的方法途径上来，本章重点介绍被克隆基因在DNA-分子上的定位和结构研究。第11章重点介绍研究基因表达和功能的方法。第12章重点介绍基因组学和后基因组学的技术。,10.1 被克隆基因的定位 10.2、 DNA测序：-基因结构的详细分析
2、10.3 研究基因结构的其它方法,*10.1 被克隆基因的定位,确定一个被克隆的基因在它所属的DNA-分子上的位置的方法有几种：如连锁图谱，限制性酶切图谱，DNA序列图谱等。具体选择哪种方法要依据被克隆的基因所涉及的DNA-分子的大小（基因组大小）而定。对质粒和噬菌体染色体这些小分子，我们使用的方法和对巨大的真核生物的DNA-分子不同。对于大的基因组，含有分子标记的遗传或物理图谱对被克隆基因在染色体或较大的DNA分子上的定位十分重要。,基因组图谱包括: 1)、以染色体重组交换为基础的遗传图谱( Genetic map) 2)、以DNA核苷酸序列为基础的物理图谱(Physical map) 。,
3、1)、遗传图谱 遗传图谱可提供: a)基因连锁群信息; b)基因排序和遗传距离的相关信息。 生物染色体上基因之间的交换和重组除了与遗传距离有关外,还受许多其它因素的影响,因此遗传图谱中基于重组率所确定的遗传图距具有相对性,即它并不能直接反映DNA 的核苷酸对数。不同生物的遗传图谱上,或者同一遗传图谱上的不同区域,每一图谱单位所代表的实际核苷酸对数往往存在很大的差异。,2)、物理图谱 物理图谱是反映生物基因组中基因或标记间的实际距离的图谱，其图距单位通常为Kb ( Kilobases) 或Mb (Megabases) 。随着越来越多的生物的遗传图谱趋于饱和，生物的物理图谱的构建逐渐成为可能。物理
4、图谱依其产生方法的不同可分为如下几种：限制酶切图谱；跨叠片段图谱；DNA 序列图谱。,a) 限制酶切图谱(Restriction Maps) 限制酶切图谱是以限制性内切酶位点为标记的物理图谱。限制酶切图谱过去仅限于一些非常小的基因组，如噬菌体、质粒等，因为大基因组所含的限制性片段数太多，以致于难以对其进行长度测定和排序。随着分子生物学技术的发展，通过使用稀有切点限制性内切酶和脉冲场电泳技术，人们已经完成了多种具有大基因组生物的限制酶切图谱的制作。,b) 跨叠片段图谱(Contig Maps)（图10-13） 跨叠片段图谱通常是以STS（序列标签位点）为标记的物理图谱。其构建过程是,先用基因组D
5、NA建立含重叠(Overlapping)克隆的基因组文库,然后通过重叠克隆间所共有的核苷酸序列将所有的克隆沿染色体排成连续的跨叠系列(Contigs)。不同克隆间的重叠关系可通过比较各克隆片段的限制酶切图谱来确立。跨叠图谱过去也是仅限于一些小基因组生物,如线虫和拟南芥等,因为传统的克隆载体所能包含的外源DNA片段最大仅是几十个kb,使得大基因组生物构建跨叠图谱所需的克隆数太多而难以完成。如今随着一些克隆大片段DNA(几百个kb) 的新型载体,如YAC、BAC 等的出现,许多生物的跨叠图谱已经或正在建立。,c) DNA 序列图谱 DNA序列图谱是指直接反映生物基因组全序列的图谱，是对上述两种物理
6、图谱的进一步发展。基因组作图的目的是揭示生物基因组的全序列。随着DNA大规模自动测序技术的不断改进，越来越多生物的基因组序列正逐渐展示于人们的眼前。通过DNA序列图谱可很容易获得相关基因定位及结构信息。 此外还发展出了基于PCR为主要技术支持的 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)图谱；SSR (Simple Sequence Repeat)图谱。,限制性酶切配合Southern Blotting分析可用于大多数的质粒、噬菌体和病毒等含有较小的DNA-分子上的基因定位。,10.1.1 克隆基因在小分子DNA上的定位 限制性位图法,10.1.
7、2 克隆基因在大的DNA分子上的定位 克隆基因在大的DNA-分子上的定位的过程通常比在小分子DNA上的定位过程要复杂，即使对于含有染色体数目比较少的真核生物，基因的定位也要首先确定其位于哪条染色体，随后才能确定其在DNA大分子上的具体位置。克隆基因在大的DNA-分子上的定位的方法包括： a. 通过电泳分离染色体； b. 利用原位杂交（in situ-hybridization）可以显示一个克隆基因在一条真核生物染色体上的位置； c. 染色体漫游/步查（chromosome walking )。,a. 电泳分离染色体,高等生物基因定位研究中，首先要确定的是基因在哪个染色体上。对于小的DNA分子，
8、利用限制性内切酶处理，通过凝胶电泳配合Southern Blotting 可比较容易的分离DNA分子，大于60kb的分子用常规方法就难以分开。对大的DNA分子（特别是染色体）如果使电场设置更复杂一些，则可以克服这些常规方法的限制性，如正交脉冲凝胶电泳（orthogonal field alteration gel electrophoresis, OFAGE 图10-4a）该方法的基本原理在第九章已介绍。在这个脉冲电场中，DNA-分子必须随着脉冲不断改变其运动方向。该方法的分辨能力达到了许多真核生物的染色体的大小范围，如酵母和丝状真菌的染色体。,OFAGE对于克隆基因在大的DNA-分子上的定位
9、非常有帮助。例如我们可以将每一个染色体的DNA从凝胶中提出，建成一系列的单一染色体基因文库。每个染色体基因文库只含有一条染色体的基因，比起一个完整的基因组文库小许多，就容易操作。另外，可以通过Southern杂交，将OFAGE分离的染色体DNA-分子固定到硝酸纤维素或尼龙薄膜上，然后通过杂交进行分析研究。这样，就可以将一个特定基因所在的染色体鉴别出来。,b.原位杂交（in situ-hybridization）,利用原位杂交（in situ-hybridization）可以显示一个克隆基因在一条真核生物染色体上的位置。 OFAGE和类似的方法目前还仅限于研究染色体较小的低等真核生物。高等真核生
10、物染色体DNA-分子，如人的一条染色体就包含10万kb或更多，这在一定程度上超出了目前的技术范围。另外，染色体DNA-分子杂交只能显示被克隆基因位于哪一条染色体上，而不能提供在这条染色体上的确切位置。对较高等的真核生物，原位杂交方法较好，因为它也能提供这个基因位置方面的信息。 在许多高等生物中，我们可以用光学显微镜观察正在分裂的细胞中的染色体（图10-5a）。每一条染色体在形状上和带形上可以区别（用不同的染色方法）。用原位杂交可以显示一个被克隆基因在一条染色体的光学显微图上的位置。,具体方法为：首先置细胞于载玻片表面，用固定液处理细胞，用RNase和NaOH温育，使RNA 降解、DNA变性。在
11、这个过程中，聚核苷酸链之间的碱基对被解离，染色体在一定程度上展开，就使一般情况下包被在染色体结构中的DNA-片段暴露出来（图10-5b）。然后，通过标记被克隆基因的一个探针，并与这些染色体制备物混合。这个探针就与它的位于染色体上的互补链杂交，通过放射自显影以一个黑色的斑点显示出来。,在确定了相关基因在染色体上的位置后，结合基因组文库的构建和筛库及序列分析就可以确定一个克隆基因在一段大的DNA-分子上的位置。,c. 染色体漫游/步查,染色体步查：是通过检测被克隆的基因的DNA的重叠片段而构建一个基因克隆图谱的技术。基因定位后，我们可以利用染色体漫游/步查法，借助已知序列的相邻基因克隆已经定位但序
12、列未知的基因。 利用染色体步查法克隆基因，需要建立两个不同限制性内切酶处理的同一条染色体的基因文库：如分别用EcoRI 或BamHI 酶切。这样，由于两种酶的切口不会重合，两个文库中这些克隆片段间是不会重叠的；如果将两条分别标有两种酶切点的DNA放到一起观察，两种酶的切点不会在同一位置（图10-6a）。,染色体步查的基本操作方法： 在染色体漫游开始时，先将已知基因的克隆（以A1为例）从文库A中提取出，利用它作为文库B的探针（图10-6a）。 在文库B中，我们可能会从一个或几个克隆(B1,I4) 那里得到阳性信号，因为这些克隆的片段会与探针中的一段重叠/杂交。 然后，再利用从文库B中发现的一个克
13、隆（如I4）作文库A 的探针（图10-6b）。该克隆可与第一个克隆（A1）及其它克隆(F2)可以杂交。 这个过程重复多次，我们就逐渐得到这些限制性片段的限制性图，最后就可由已知基因（A1）到达了目的基因（因为我们事先已经知道目的基因的确切位置图10-6）。,染色体漫游方法是一种难掌握和费时间的方法。但该方法又是一种非常实用有效的基因克隆和定位方法。,10.2,10.2、 DNA测序： -基因结构的详细分析,DNA-测序是分子生物学的最主要的方法之一，用这种方法可以准确地确定一个DNA-片段的核苷酸序列。DNA-测序的方法已经存在了很长时间，但能够快速有效地进行序列分析还是在20世纪70年代末才
14、成为可能。传统测序的方法包括: 1、英国的F.Sanger和 A.R.Coulson的双脱氧链终止法， 2、美国的 A.Maxam 和W.Gilbert的化学降解法。 这两种测序的方法虽不同，但同样有用。利用它们，可在很短时间内得到具有数千个碱基的DNA-序列。DNA-序列在今天是一个克隆基因的首要的和最基本的信息。 一个长的DNA-序列分析：a、分段测序法 b、亚克隆文库法,第一个完全测序的DNA-分子是细菌噬菌体X174的染色体，它的长度为5386 bp，是1975年完成的。 1977年又进行了对病毒SV40 (5243 bp)、1978年进行了对pBR322 (4363 bp) 的测序。
15、随后，逐渐开始了对更大分子的测序：Sanger研究小组在1981年发表了人的线粒体基因组(16.5 kb)、1982年又发表了细菌噬菌体（49 kb）的序列。 今天，对5-10 kb分子的测序已是常事，许多研究机构已经有足够的经验，去获得这些大量的信息。 现已完成了包括拟南芥、水稻、杨树、白菜、小麦AD基因组、人等多种大基因组生物的测序。,10.2.1 Sanger-Coulson-方法：-双脱氧链终止法,该方法的技术要点是通过合成一系列长度只相差一个核苷酸的DNA 分子片段通过电泳并结合放射自显影，依次排出要测序的DNA 分子序列。,通过作图红框中我们可以得到长度只差一个核苷酸的一系列核苷酸
16、片段从最短的（首先合成的）片段读依次为：ATTGCGATTCG,Sanger-Coulson-方法的特点 1、需要在单链DNA上进行，因此， 2、对要测序的分子一般是克隆到M13载体中。 3、在本办法中，用酶法合成第二条链，它与第一条模板链是互补的。 Sanger-Coulson-方法包括以下环节： a)引物退火 b)互补链的合成 c)在4个加入ddATP、 ddTTP、 ddGTP、 ddCTP单独反应中，我们得到4个分别在dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP中断链的家系 d)从放射自显影胶片上读出序列,引物退火 用双脱氧链终止法进行序列分析的第一步是让一个寡核苷酸引物与M13-分子
17、在多聚衔接物附近的一段上与载体结合（图10-6a）。这个引物用作合成互补链的起始点，这个反应是通过DNA-聚合酶Klenow-片段或者一种相关酶如T7 DNA聚合酶催化的。（4.1.3节介绍过）该酶需要一个双链片段作为开始才可合成第二条链。,互补链的合成 在加入了DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)的聚合反应体系中，还加入一种改变了的核苷酸，即一种双脱氧核苷酸（如ddATP），这种双脱氧核苷酸同样能被有效地合成进延伸的聚核苷酸链中，但是，一旦这种双脱氧核苷酸插入，它就阻止了这条链的继续合成，新链的合成就在此停止 。这是由于在ddATP的糖的第3位上缺少一个羟基（图10-6b）。这个羟基刚好对下一个核苷酸的连接是必须的。,
