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1、,Separation and Assays for Immune Cells,免疫细胞的分离与检测,免疫细胞的种类,淋巴细胞：T细胞、B细胞、 NK细胞等 单核巨噬细胞 树突状细胞 粒细胞,分离免疫细胞的样本来源,外周血 脾脏 淋巴结 胸腺 骨髓,分离免疫细胞的目的,检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株,分离免疫细胞的一般原理,物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等,本章主要内容,1. 免疫细胞的分离与纯化,2. 淋巴细胞的数量检测,4. 吞噬细胞功能检测,3. 淋巴细胞的功能检测,第一节 免疫细胞的分离与纯化,白
2、细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化 淋巴细胞亚群的分离 细胞活力的检测,一、白细胞的分离,细胞密度不同，沉降速度不一样。 粒细胞1.092, 红细胞1.093, 沉降速度不一样。 自然沉降法(血浆、白细胞、红细胞) 聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。 (会增加白细胞的黏性),二、外周血单个核细胞的分离,外周血细胞的密度 血小板：1.030-1.035 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 粒细胞：1.092 红细胞：1.093,外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC):
3、 Monocyte、Lymphocyte,聚蔗糖（Ficoll）泛影葡胺分层液法,（一）原理和方法,1. 单次密度梯度分离法 单次密度梯度 连续密度梯度,2. 试剂：FicollHypaque,Ficoll：聚蔗糖，MW：40 000，高密度，低渗透压、无毒性，6Ficoll密度为1.020,Hypaque：泛影葡糖胺，34 hypaque的密度为1.200，用于调整分离液的密度。,分离人外周血单个核细胞用1.0770.001的密度分离液。,3. 离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09) 上层，经离心后细胞可分为不同的区带。,4. 收集细胞 5. 洗涤、计数,（二）方法评
4、价,是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95 细胞得率高，可达80,三、淋巴细胞和单核细胞的分离,（一）红细胞的去除：低渗0.83NH4Cl处理,（二）血小板的去除：离心洗涤；FCS,（三）单核细胞的去除 黏附去除法、羰基铁粉吞噬法,（四）Percoll离心法纯化淋巴细胞与单核细胞,单核细胞的去除,黏附去除法：根据单核细胞具有黏附作用而去除（培养；凝胶柱） 羰基铁粉法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力（Ficoll离心；磁铁）,粘附贴壁法,单核细胞贴壁生长 玻璃、塑料平皿/培养瓶、37、1h 取未贴壁细胞-淋巴细胞（T、B） 刮下贴壁细胞-纯单核细胞 缺点：B
5、细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率,过柱吸附法,层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中 洗脱-淋巴细胞 层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶 粘附能力：单核细胞淋巴细胞,Percoll分层液法,Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒、无刺激。 Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。,将PBMC加在分离液上低速离心后可分离PBMC中的单核细胞和淋巴细胞,淋巴细胞亚群的分离,E花环分离法 尼龙棉柱分离法 补体细胞毒法 亲和板结合分离法 免疫磁珠分离法 细胞分选术,E花环分离法,T细胞 （CD2/LFA2/E受体）,绵羊红细胞 SRBC,E花环,比重增
6、加,Ficoll-Hypaque 分离液分离,低渗,尼龙棉柱分离法,尼龙棉装入5ml注射器中,加入淋巴细胞悬液,37、 5 CO2、12h,RPMI 1640完全培养基灌洗,洗脱液中为T细胞,原理 B细胞可粘 附尼龙毛； T细胞不具 有粘附活性。,方法评价：,实验室常用分离方法之一 简便、易行 获得细胞纯度较高 T细胞90 B细胞80 尼龙毛柱法E花环法，T细胞可达99以上,（三）补体细胞毒法 原理：免疫细胞表面的某种Ag与相应Ab结合，加入补体，借助补体介导的细胞毒作用，破坏Ag阳性的细胞，收集Ag阴性的细胞。,如：在LC悬液中加入抗人Ig抗体去除B细胞，得到T细胞。,如：在T细胞悬液中加入
7、抗CD4抗体去除CD4+ T细胞，得到CD8+T细胞。,亲和板分离法,（五）免疫磁珠法,原理： 将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB）,加入细胞悬液，IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应，形成抗体/抗原的复合物。,外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB 。,分法： 直接法 间接法,免疫磁珠法细胞分选过程,免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置,特点: 简便, 快速, 费用低, 无需特殊设备,全自动细胞分选仪,评价,高纯度（9599） 高回收率（9095） 高活性（99100） 效果可与流式细胞仪媲美， 但更经济、省时、简便、快速,（六）流式细胞仪分选
8、技术,经典方法： 离心 粘附法 补体细胞毒法 淘洗法 免疫磁珠法,经典分离方法的局限性 纯度 稀有细胞,？ 高速 高纯度 高精度,流式细胞仪（FCM）具有高速、 高纯度、高精度优势。,激活细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。 Fluorescence activated cell sorter （FACS）,细胞分选,细胞分选（cell sorting）：有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。,四、吞噬细胞的分离,吞噬细胞种类,大吞噬细胞：单核细胞、巨噬细胞 小吞噬细胞：中性粒细胞,巨噬细胞：斑蝥敷贴法、腹腔渗出分离法、 中性粒细胞：右旋糖酐分离法、FicollHyp
9、aque分层液分离法,吞噬细胞分离法,斑蟊敷贴法分离人巨噬细胞,20世纪70年代由我国免疫学家创立 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞 分离方法,腹腔渗出法分离腹腔巨噬细胞,腹腔注射诱导剂,34 days,腹腔内注射肝素PBS,处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）,洗涤细胞、计数,3ml肝素抗凝全血1/4体积6右旋糖酐生理盐水，室温静置3040min，取上层白细胞，0.8NH4Cl溶解红细胞，离心，取细胞沉淀用FicollHypaque分离液分离中性粒细胞和单个核细胞。,右旋糖酐法分离中性粒细胞,外周血中性粒细胞分离(Ficoll-Hypaque),五、细胞活力检测,细胞活力：指细胞存活的数量，
10、一般用百分表示。 通常活力应95% 方法：苔盼蓝染色法 活细胞：不着色 死细胞：着色,白细胞的分离 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞和单核细胞的分离 淋巴细胞亚群分离 吞噬细胞的分离,小结：免疫细胞的分离与纯化,第二节 淋巴细胞的数量检测,T细胞数量检测 B细胞数量的检测,（一） 根据T细胞表面CD分子检测 间接荧光免疫法 免疫组织化学法：酶标、金标法 微量细胞毒试验 花环技术,一、T细胞数量检测,（二）根据T细胞受体检测 可溶性抗原肽-MHC四聚体复合法 Tetramer,1. 间接荧光免疫法,2. 免疫组织化学法： 酶标：ABC，APAAP 金标法,3. 微量细胞毒试验,针对淋巴细胞CD分
11、子Ab与其相应的CD分子结合， 借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面Ag 的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内 ，使之着染红色，而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因 而不着色。计数着色细胞数,计算相应细胞的%。,微量细胞毒试验,淋巴细胞,抗CD分子单抗 补体,伊红染色,细胞着色,4. 花环技术E花环,总花环形成率（Et）： 4过夜，60%80 活性花环形成率（Ea）： 室温低速短时离心，2040,E受体: CD2，表达于T细 胞、胸腺细胞、NK细胞,T cell,SPA-IgG（anti-CD）-CD分子-T细胞亚群,4. 花环技术葡萄球菌花环法,4. 花环技术抗体致敏细
12、胞花环法,SRBC-anti-CD-T细胞（CD分子）,(三) 可溶性抗原肽-MHC四聚体复合物法,是一项近年发展起来的新技术 与FCM联合, 定量检测抗原特异性T淋巴细胞,1. mIg的检测: 酶免疫法、荧光免疫法 2. CD抗原检测 酶免疫组织化学法 间接荧光免疫法 流式细胞术 3. 受体检测（FcR、CR） EA花环 EAC花环 小鼠红细胞花环,二、B细胞数量检测,EA花环形成试验,Fc受体,B cell,B cell,B cell,B cell,EAC花环形成试验,补体受体,小鼠红细胞受体： 慢性B细胞白血病 方法简单，鉴定类型,第三节 淋巴细胞功能检测,T细胞功能检测 B细胞功能检测
13、 NK细胞活性测定,一、T细胞功能检测,Produce cytokines Cytotoxic action Mediate DTH,T细胞的功能,T细胞功能检测试验,T细胞增殖试验 CTL介导的细胞毒试验 T细胞分泌功能检测 检测T细胞功能的体内试验,T细胞增殖试验,形态学法 3H-TdR掺入法 MTT比色法 CFSE标记染色法,形态学法,PBMC,PHA/ConA,5CO2 、 37培养72h,细胞涂片染色,显微镜检查,未转化淋巴细胞,转化的淋巴母细胞,转化率（）,转化的淋巴细胞数,计数的淋巴细胞总数,X100,Sitmulated by mitogen or antigen,48h,3H
14、-TdR,Count CPM,3H-TdR掺入法,CFSE的前体（CFDSE）可进入细胞，降解后形成CFSE，在一定波长的光激发下可发出荧光。当细胞分裂时，CFSE平均分配到子细胞中，使荧光量减半，再采用流式细胞仪分析细胞增殖活性。,CFSE标记染色法,T cell proliferation analyzed by CFSE labeling,T细胞介导的细胞毒试验,CTL杀伤靶细胞的机制,通过颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞 通过FasFasL介导细胞凋亡,CTL介导细胞毒作用的检测方法,形态学检查法 51Cr释放法 细胞凋亡检测法 （1）形态学检测法 （2）DNA Ladder （3）ELISA
15、 （4）Flow cytomery,Cytotoxicity Assays (51Cr release),B细胞增殖试验 溶血空斑试验 ELISPOT检测抗体分泌细胞 抗体的检测,B细胞功能检测,Direct assay for IgM-secreting plasma cells (primary response),Indirect assay for IgG-secreting plasma cells (secondary response),ELISPOT检测抗体形成细胞,第四节 吞噬细胞功能测定,中性粒细胞 巨噬细胞,趋化功能检测 吞噬和杀菌功能测定,中性粒细胞功能检测,中性粒细胞趋化功能检测 琼脂糖平板法,中性粒细胞趋化功能检测 Boden 小室法,Boyden Chamber,Shi et al. J Immunol Methods, 1993, 164: 149,中性粒细胞吞噬功能测定,中性粒细胞,白色葡萄球菌,显微镜观察,中性粒细胞吞噬功能测定,巨噬细胞功能检测,碳粒廓清实验 吞噬功能检测 巨噬细胞溶酶体酶的测定 细胞毒作用测定 巨噬细胞促凝血活性测定 巨噬细胞产生细胞因子的检测,巨噬细胞,鸡红细胞 白色念珠菌 酵母细胞,孵育,涂片 染色 镜检,计算吞噬率和吞噬指数,巨噬细胞吞噬功能检测,
