《生物制药第五章大环内酯类抗生素》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物制药第五章大环内酯类抗生素（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第五章 大环内酯类抗生素,第一节 概述,大环内酯类抗生素 是一个大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和1-3个分子的糖相联结的一类抗生物质。（红霉素的结构）,根据大环内酯结构不同分为三类：多氧大环内酯，多烯大环内酯，蒽沙大环内酯。,一、多氧大环内酯： 根据大环内酯的碳元素数又分为12元环，14元环，16元环。 结构特点：大部分都联结有二甲胺基糖，因而显示碱性。有的不含二甲胺基糖，因而显示中性。 作为医疗用的多为碱性大环内酯，重要的有： 14元环：红霉素，竹桃霉素。 16元环：吉他霉素，交沙霉素，螺旋霉素。 12元环抗生素目前没有用于临床。 作用机制：与核糖体50s亚基的特殊部位结合，选择性地抑制原
2、核细胞的蛋白质合成。,二、多烯大环内酯,结构特点：由2537个碳原子组成大内酯环，在环的一部分有共轭多烯结构，对应部位有羟基，并由苷键连接一个或多个氨基糖。由共轭双键数目不同分为四烯 ：如两性霉素。 五烯 ： 六烯 ：制霉菌素 七烯 ：两性霉素B 作用机制：与真菌细胞膜的固醇类成分结合，改变细胞膜的通透性，导致真菌的死亡，对细菌无效。,三、蒽沙大环内酯(环桥类抗生素):,一个脂及链桥经过酰胺键与平面的芳香基团的两个不相邻位置相联结的环桥类状化合物，其脂肪链的结构和立体化学与大环类酯相似。该类抗生素的抗菌谱广，有抗癌活性。分为两小类: 1 含萘醌的抗生素：利福霉素，多利霉素等。 2含苯醌的抗生素
3、：如土块霉素。,利福霉素,由地中海诺卡菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效。临床多与其他抗结核病药物合用治疗各型结核病和治疗耐药金黄色葡萄球菌的严重感染，还用于治疗麻风病。,第二节 红霉素类抗生素生产,这类抗生素中发现最早的是红霉素，其抗菌作用最强，研究和应用也最普遍。 一 红霉素类抗生素的理化性质及药理特性 1、结构 红霉素从化学结构来划分也属于糖苷类抗生素，但由于分子内含有多羟基的大环内酯，所以又不同于一般氨基糖苷类抗生素，其化学结构如下：,2 物理性质 为一个碱性化
4、合物,容易和无机或有机酸形成在水中溶解度较大的盐,如临床上使用的乳糖酸红霉素。红霉素碱可以有三种不同的结晶形式,结晶水含量和熔点各不相同,但生物活性和其他性质未变。容易溶于醇、醚等有机溶剂。在水中溶解度随温度升高而降低，55为最小，因此工业上利用此性质加温到45- 55并保温，使红霉素碱从水中析出。,3、稳定性红霉素在干燥状态下稳定，结晶在室温下可保藏一年，效价不降低。在PH6-8的水溶液下稳定，4下放3个周，效价不降低。如在室温下，1星期后略有损失，但再经7个周，其效价并不再降低。红霉素溶液在60 保持5min并不破坏，但在Ph6-8范围以外的水溶液，经24h即失效。,4化学性质 碱性条件下
5、，内酯环容易破裂，加酸后，也不再成环。 在酸性条件下，苷键容易水解，经1mol/L盐酸甲醇溶液的温和水解，其中的一个苷键破裂，得到红霉糖胺和红霉糖。红霉糖胺再经6mol/L盐酸水解，得到去氧氨基己糖。 红霉素中的红霉内酯环有一个活泼的酮基，用各种不同试剂解离出红霉糖和去氧氨基己糖都会改变这个结构，因此得不到游离的红霉内酯。,二 抗菌作用和应用范围,红霉素是广谱抗生素，但以革兰氏阳性菌(如葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌，白喉杆菌、炭疽杆苗，梭状芽孢杆菌等有强大的抗菌作用)为主，其抗谱类似青霉素，对某些革兰氏阴性菌(如脑膜炎双球菌，流感杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌等)亦有效。红霉素在临床上的特点是对青霉
6、素耐药的金黄色葡萄球菌也敏感，因此常用于各种耐青霉素的葡萄球菌感染或对青霉素有过敏性的病人。此外红霉素对某些螺旋体、放线菌、溶组织阿米巴原虫，立克次氏体等也具有抑制作用。红霉素的毒性极低，临床应用后易为一般病人所耐受，很少发生由于毒性反应而需要停止用药的情况，长期或大剂量服用时可引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。,三、红霉素的发酵工艺及过程,红霉素的产生菌是红色链霉菌(Streptomyces erythreus)。红霉素是红色链霉菌在特定培养条件下所产生的一种代谢产物。它是多组分的抗生素，其中红霉素A为有效组分，红霉素B、红霉素C为杂物。现用的产生菌在其生物合成过程中不产生红霉素B，故红霉素C为
7、国产红霉素的主要杂质。红霉素C和红霉素A的结构极为相似，但红霉素C抗菌活性比红霉素A低很多，其毒性却是它的二倍。由于两者在提炼过程难以分离，故要提高产品质量、提高产品的抗菌活性和降低毒性(即减少成品中的红霉素C含量)，同时又要减少提取精制过程中产量的损耗，这就必须控制发酵液质量，要求发酵液中红霉素C的含量降低，并提高有效组分红霉素A的比例。,1、菌种,我国60年代开始红霉素的工业生产，采用的产生菌是P3t一102菌株，生产水平不高，并易产生噬茵体污染。由于菌种选育工作的发展，选育了抗噬苗体的菌株，并使用自然分离，紫外线、氮芥子气、硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、二氧化碳、激光及快速中子处理等
8、方法选育高产菌种。因此，目前生产上使用的菌种不但具有抗噬菌体的特性，且生产能力也有提高。随着菌种选育的发展，从控制红霉素生物台成的代谢路线考虑进行定向筛选，得到抗乙硫氨酸的菌株，并采用原生质体融台的方法获得高产优质的菌种。经生产实践，其红霉素A的含量高，红霉素C的含量低，结合工艺控制条件的改进，发酵单位提高15左右，并保证了成品的质量。,2 发酵工艺及过程,控制要点,种子 红霉素斜面孢子培养基是由玉米浆、淀粉、氯化钠、硫酸铵等组瘟。其中玉米浆质量对孢子的外观及生产能力有直接影响。 从抱子外观来看，玉米浆除了对背面色素孢子及丰满程度有影响外，还影响孢瓶内黑点的数量。红霉素孢瓶内的“黑点”是指灰色
9、焦状菌落，它的生产能力比正常菌落低(正常菌落呈草帽型，成熟孢子为深米色)。有的生产厂以蛋白胨代替玉米浆作孢瓶培养基的有机氨源，这样会使黑点减少甚至不出现，但其孢子量少，未能用于生产(除特制的蛋白胨外)。日前仅能从母瓶斜面接至子瓶斜面时尽量挑选正常集落制备孢子悬浮掖，以防焦状苗落继续传代。若孢瓶内黑点过多不能用于生产，一般控制在10点瓶以内。据介绍，四环素孢瓶所用的琼脂经水浸洗后质量稳定。但红霉素孢瓶不同，用水漂洗后的琼脂制得的孢瓶生产能力低，这可能与红色链霉菌需要微量元索有关。 孢子培养基消毒后必须重视冷却时间的控制，要求快速为妥，冷却时间过长对孢子生长不利。未接种的空白斜面需放置两周，待表面
10、无水分方可接孢子。孢瓶培养的温度37。,发酵培养基,成分由黄豆饼粉、玉米浆，淀粉、葡萄糖、碳酸钙、硫酸铵、磷酸二氢钾等组成。 (1)碳源 以葡萄糖为主(约占80一85)，其次是淀粉(占1525)。为了降低成本与节粮，生产上常用母液糖代替固体葡萄糖。 (2)氨源 以黄豆饼粉为主，其次是玉米浆和硫酸铵。中间补料有花生饼粉、蛋自胨、酵母糟及氨水。 (3)前体 根据红霉素生物台成途径，红霉索C转为红霉素A需要甲基供体，生产上采用发酵过程加入丙酸或丙醇作为前体以提高红霉素A的产量。丙酸作前体时其加入量、加入速度及加入浓度控制不当易使苗丝自溶，影响正常发酵，甚至全罐损失，最好加入水稀释降低丙酸浓度，减慢加
11、入速度或用丙酸钠代替。丙醇作前体时，代谢较稳定，对pH影响小，发酵单位及成品得量都比较高，但要注意防火安全。,培养条件的控制,(1)通气 搅拌发酵罐的通气量一般为1：0812vvmin ，增大空气流量和加快搅拌转速会提高发酵单位，但必须加强补料的工艺控制防止菌丝早衰自溶，否则会给成品质量带来不良影响。较佳通气量的控制可减少动力的消耗，同样达到高产优质。过低的通气量亦会导致发酵液转稀。 (2)温度 一般采用全程31培养，遇发酵激烈有转稀趋势时适当降低培养温度。红色链霉菌对温度较敏感，若前期酵 33 培养则菌丝生长繁殖速度加快，40小时粘度即达最高峰，但衰老自溶亦快，发度酵液粘度容易下降。31 培
12、养菌丝生长虽比33 慢，48小时粘度方达最高峰，但衰老较慢，使粘度下降速度减缓，转稀时间推迟，见下图。后期的罐温更需控制，温度偏高会使苗丝在短时问内迅速自溶。,发酵温度对红霉素发酵的影响,(3)pH值 整个发酵过程维持在6.5-7.2菌丝生长良好，不自溶，发酵单位稳定。发酵过程中的pH和培养基的原始pH与原材料的质量及消毒操作都有关，如原始pH微带酸性，较慢地向碱性转变时刚为正常。如在接种后24小时内pH过低或偏高。菌丝生长较慢，生物合成水平的差别也很显著，特别在发酵前期，当pH为5.76.3时发酵终了的单位仅为对照的一半。 （4）中间补料 发酵过程中还原糖控制在1.2一1.5范围内，每隔6小
13、时加入葡萄糖，直至放罐前1218小时停止加糖。有机氮源一般每天补三至四次，根据发酵液粘度的大小决定补入量的多少，若粘度低可增加补料量，反之则减少补料量，粘度过高还可适量补水，放罐前24小时停止补料。,3红霉素提炼的工艺,溶媒法提炼红霉素的工艺流程,ZnSO4:沉淀蛋白质，促使菌丝结团加快滤速。 ZnSO4呈酸性,为了防止红霉素在酸性条件破坏，用碱调pH至7.2到7.8。,溶煤萃取结合中间盐沉淀提炼红霉素的工艺流程,用薄膜浓缩法提炼红霉素,红霉素提炼工艺要点,根据红霉素的理化性质，红霉素是一种碱性抗生素，利用它在不同酸、碱度能溶解在不同溶剂中的特性，采用在醋酸丁酯及在水溶液中反复萃取，以达到提纯
14、和浓缩的目的，最后在含有2730万uml的丁酯溶液中进行冷冻结晶，即制得红霉素碱成品，其工艺要点分述如下： (一)发酵液的预处理和过滤发酵液中除含有低浓度的（约占0.8%）红霉素外，绝大部分是菌丝体和未用完的培养基以及各种代谢产物如蛋白质，各种色素等。尤以蛋白质的存在在溶媒萃取时将产生严重乳化现象，给提炼带来困难，因此需对发酵液进行预处理和过滤。目前一般采用硫酸锌来沉淀蛋白质，并促使菌丝结团加快滤速，由于硫酸锌呈酸性，为了防止红霉素在酸性下破坏，故需用NaOH调pH至7.27.8，同时控制加料速度并开始搅拌，防止局部过酸。但由于锌离子的毒性，给滤渣处理带来一定困难，故近来有用碱式氯化铝来代替硫
15、酸锌，有利于处理滤渣。对染菌的发酵液可进行加温60一80方法处理.,(二)防止和去除乳化为了减轻乳化现象，关键存于发酵液处理得好，过滤质量高，保证滤液澄清，无混浊现象。去乳化剂的选择也很重要，早期用溴代十五烷吡啶(PPB)作为红霉素提炼的去乳化剂。因为它是碱性物质，在碱性下易带入丁酯相，对成品色级有一定影响。现改用十二烷基磺酸钠(DS)，因后者是酸性物质，在碱性下留在水相，使成品色泽较用PPB时有所改进，同时也解决了由PPB带来的污染。,(三)pH值和温度在萃取过程中，碱化和酸化的pH值对收率和产品质量部有直接影响。碱化时pH高些，对提取有利，但不能过高，否则会引起红霉素的碱性破坏，同时碱性高
16、对乳浊液的稳定性有利，使乳化严重。 pH过低，对萃取也不利，影响收率。pH控制在100.5范围较适宜。酸化时pH控制在4.90.3范围，若酸化pH再偏高对红霉素稳定性有好处，但萃取则不完全，影响收率；若pH再偏低时，对萃取有利，但红霉素就十分不稳定，易发生酸性水解，影响收率和产品质量。因此，当红霉素转入缓冲液后，要立刻用10%NaOH调pH78之间，且加入适当丁酯。由于红霉素在水中溶解度以55为最小，因此，当红霉素从水相转入溶媒时，可适当加温至30一32。从缓冲液转入第二次丁脂时，一般也加热到38-40 。加温的目的在于减少红霉素在水相中的溶解度，有利于萃取。,(四)几条工艺路线之比较溶媒反复
17、萃取工艺路线能使生产连续进行，周期短，收率高，产品质量较好，但溶媒用量大，需超速离心设备和通风防火防爆措施等，但最终成品生物效价不够高，需丙酮重结晶后，生物效价才能达到我国1985年版药典标准。薄膜浓缩法工艺路线的特点是操作简单，不用超速离心设备和大量溶媒，投产较易，但产品质量较差，要得到效价高的产品，还需用丙酮重结晶等。中间盐沉淀工艺是采用在一次丁酯萃取液或二次丁酯萃取液中，加入硫氰酸盐、草酸、乳酸等生成相应的红霉索复盐作为中间体，然后再转为红霉素碱或其它红霉素盐，以纯化红霉素。其中以红霉素乳酸盐沉淀法已为国内许多生产厂所采用，一次结晶成品纯度可达930一960单位毫克，省去用丙酮重结晶等处理。,
