病毒感染性疾病的实验室诊断卢忠心

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1、病毒感染性疾病的实验室诊断,武汉市中心医院 卢忠心,病毒的发现与研究历史,病毒病由来已久 公元前二至三个世纪 天花 中国 公元十世纪 接种人痘预防天花 1796英国医生琴纳 牛痘使人预防天花 阿里斯多德在公元前四世纪 狂犬病 法国人巴斯德在1884年 狂犬疫苗,病毒学的发展历程,病毒的病原研究阶段 病毒的化学和结构研究阶段 病毒研究的细胞水平时期 分子病毒学的研究时期,病毒病的病原研究阶段,自病毒发现直到上个世纪30年代初，病毒学研究主要集中在：分离和鉴定 引起各种病毒性疾病的病毒；病毒对疾体所引起的特异性病理效应；病毒 的传播方式和感染宿主范围；各种理化因子对病毒感染的影响等方面。 在这一阶

2、段，人们对病毒本质的认识还很肤浅，认为病毒是一种与细菌类 似的病原体，所不同的仅在于病毒必须在生活的细胞内才能繁殖，再就是 体积十分微小，以致在显微镜下不能见到，能够通过细菌滤器。这也正是 在那一时期把病毒称之为“超显微的滤过性病毒”的原因。,病毒的化学和结构研究阶段,1934年M.Schlesinger获得了纯化的噬菌体；1935年，美国生化学家Stanley第一次提纯了烟草花叶病毒（简称TMV），因为这项贡献 1946年被授予诺贝尔奖，这是病毒学领域第一个获此殊荣的科学家；1938年W.J.Elford测定了各种病毒颗粒大小； 1939年，G.A.Kansche在电镜下直接观察到TMV ；

3、1955年，Scaffer和Schwerdt成功结晶了脊髓灰质炎病毒，这是第一个被结晶出来的动物病毒；等等。 这一阶段，病毒学工作者主要采用敏感动物（如小白鼠）或动物胚胎（如鸡胚）来研究病毒，分离鉴定了近百种病毒。同时在机体水平上研究了病毒的繁殖、发病机理和免疫反应等。只是微生物学的一个分支。,病毒的细胞水平研究时期,利用大肠杆菌研究噬菌体的感染过程取得了迅速发展 组织培养技术开始应用于动物病毒的研究 我国学者黄祯祥早在1943年就利用鸡胚组织块在试管内进行病毒传代、定量滴定及中和试验。 组织培养技术对动物病毒研究所作的贡献主要包括：病毒转录新途径和翻译新途径的发现；病毒对宿主范围的选择；某些

4、肿瘤病毒引起的细胞转化；某些病毒侵染引起的细胞融合；发现有的病毒核酸由若干片段组成；有的病毒核酸具有极性的不同，如小RNA病毒为正链RNA病毒，正粘病毒为负链RNA病毒。 植物病毒不断有重要的发现 此阶段，病毒学逐步形成了一门独立的学科。,分子病毒学的研究时期,自从1953年DNA双螺旋结构理论建立以来，由于分子生物学的迅速发展，使病毒学的研究步入了分子病毒学的发展时期，分子病毒学也正是分子生物学的发展过程中应运而生。分子病毒学的发展是各相关学科如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学与病毒学理论和技术相互渗透的结果。尤其是分子生物学新技术的发明极大剌激了分子病毒学的发展。,分子病毒学的研究时

5、期的研究成果（一）,分子病毒学的研究时期的研究成果（二）,病毒感染性疾病,肝炎病毒（Hepatitis Virus） 人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV） 人乳头瘤状病毒（human papillomavirus , HPV ） EB病毒（Ebstein-Barr Virus, EBV） SARS冠状病毒(SARS-associated coronavirus, SARS-CoV) 甲型H1N1流感病毒（Influenza A(H1N1) virus ） 手足口病病毒（Hand, foot and mouth disease Virus ）,肝炎

6、病毒（Hepatitis Virus）,引起肝炎的病毒有多种类型，包括甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus, HDV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)等，分别能够引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型5种肝炎症状。近年又发现有己型肝炎（HFV引起）和庚型肝炎(HGV引起)出现。,（一） 乙型肝炎病毒,结构和特点： HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 H

7、BcAg：仅存于感染的肝细胞核内， 一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好,HBV感染的诊断 ELISA方法，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（两对半）：比较简单，而且敏感性较低。 内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法：可直接确定临床标本中HBV DNA的存在。比较敏感，能检测到0.1pg的HBV DNA。 荧光定量PCR方法：可检测到200copy/ml的HBV

8、DNA。 可 检出杂交法测定阴性而具有不同HBV血清学标志的血清标本中的 HBV DNA。可检出HBs Ag阳性而Hbe Ag阴性携带者的HBV DNA。 可检出慢性HBV感染-干扰素治疗后转阴的患者血清中残存的HBV DNA。,（一） 乙型肝炎病毒,应用核酸扩增技术(NAT)是降低HBV残留危险性的重要策略,病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性,（二）丙型肝炎病毒,感染特点： HCV在血中含量极微 输血后肝炎主要致病因子 免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一 有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成

9、功,单链RNA,HCV的流行病学,全世界的感染人群约有1.7亿 75% HCV感染发展成慢性 HCV感染发展成有症状的肝病需要十年以上 可引起慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌 通过输血、静脉用药传播 血清中出现HCV抗体在感染后54192天,ELISA方法检测HCV抗体：筛查试验 RIBA：确证试验 HCV RNA检测：确证试验,HCV感染的诊断,抗HCV筛查及确认试验结果的解释,HCV-RNA定量检测的临床意义 早期诊断： HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性：抗-HCV滴 度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。

10、 HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。 慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测 可以鉴别活动性、复制程度。,人类免疫缺陷病毒(HIV),1982年发现第1例经输血传播HIV 1985年开始检测血液和血液制品 还可通过母婴垂直传播和性接触传播 可变的潜伏期 普遍的症状包括夜汗、体重下降、 腹泻、鹅口疮、紫癜 慢性感染，但多种药物治疗可降低病毒滴度,人类免疫缺陷病毒(HIV),艾滋病有三个特性： 获得性-艾滋病并非先天具有，而是后天获得。 免疫缺陷-AIDS的发病机理在于，HIV通过造成人体免疫系 统的损伤，进而导致免疫系统防护功能的减低甚至丧失。 综合症-

11、在临床症状方面，由于免疫缺陷导致的各个系统的 机会性感染、肿瘤而出现复杂的伴随症状群。,人类免疫缺陷病毒(HIV),HIV, the virus that causes AIDS, is shown budding out of a human immune cell.,人类免疫缺陷病毒(HIV),HIV病毒：多亚型和多变异 HIV-1和HIV-2 M组、O组和N组 亚型：A-K CRF：基因重组亚型，主要是HIV-1型 毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和B亚型 重组

12、亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重组流行、泰国的A/E重组,HIV在外界的抵抗力 HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失 HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多 对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于HIV,人类免疫缺陷病毒(HIV),HIV感染的三种结局 典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90% 快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一性。 长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在8%-1

13、0%。,人类免疫缺陷病毒(HIV),HIV感染的三种结局 典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90% 快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一性。 长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,人类免疫缺陷病毒(HIV),HIV抗体的检测 P24抗原的检测 HIV 核酸检测,HIV感染的实验室诊断,酶联免疫吸附试验(ELISA) 明胶凝集试验 各种快速诊断试剂 检测亚型包括HIV-1、HIV-2和HIV-1型的O亚型，窗口期由10周缩短至34周。,HIV抗

14、体的检测,HIV抗体的检测 按规范要求，我国采供血机构进行血液筛查和各医疗卫生机构常规筛查检测宜采用ELISA法。对用ELISA试剂或快速诊断试剂进行的筛查实验如呈阴性反应，即报告HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本，筛查实验室应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂进行重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药品监督管理局(SDA)注册批准、批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。,人类免疫缺陷病毒(HIV),免疫印迹试验 条带免疫试验 免疫荧光试验,HIV确认试

15、验,ELISA双抗体夹心法 阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。HIV-1 P24抗原检测阴性，只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。 在窗口期检测P24抗原是早期辅助诊断和进一步缩短窗口期的一种方法，还可用于HIV阳性母亲所生婴儿的早期辅助鉴别诊断。,P24抗原的检测,检测HIV RNA通常使用PCR或RT-PCR技术， 核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验等 注意： HIV核酸定性检测阴性，只可报告本次实验结果阴性，但不能排除HIV感染；HIV核酸检测阳性，可作为诊断HIV感染的辅助指标，不能单独用于HIV感染的诊断，报告定性检测结果时还

16、应注明反应条件和所使用的引物序列。报告HIV核酸定量检测结果时应按照仪器读数报告结果，注明使用的试验方法、样品种类和样品量，当测定结果小于最低检测限时，应注明最低检测限水平，低于最低检测限的结果不能排除HIV感染。,HIV核酸检测,CD4+T淋巴细胞计数 血浆HIV RNA水平(病毒载量) 这两项实验可以为临床医生提供病人病毒水平、免疫状态的相关资料，是预测疾病进程的可靠指标，还可独立预测艾滋病临床过程和生存期。,HIV感染的实验室监测,流式细胞仪是检测CD4+T淋巴细胞计数的标准方法，可以得出CD4+T细胞占淋巴细胞的比值及绝对值。CD4+T细胞计数是艾滋病诊断、疾病分期的实验室标准指标。,CD4+T淋巴细胞计数,HIV病毒耐药分为原发性(Primary)及继发性(Secondary) 原发性HIV病毒耐药：指那些直接影响抗病毒药物作用靶点的变异，具有药物特异性，可降低抗病毒药物敏感性 继发性变异又称为补偿变异：常出现于原发性变异已存在的病毒基因组中，原发性变异可造成复制关键酶的改变，导致病毒动力学的不利，继发性变异可纠正由原发性变异导致的不利，提高病毒的耐药性，对原发性变异起到保护和促进作用,