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1、1,HIV/AIDS 实验室检测,首都医科大学附属北京地坛医院 首都医科大学传染病研究所 魏红山,要点概述,2,HIV实验室检测的基本目的,为HIV感染提供确认，病程监控，以及预后判定提供依据 为输血提供安全保障，用于献血员筛查 服务于自愿咨询人员，提供自愿健康体检筛查 服务于特殊的医疗过程，如器官移植，手术，输血前后的筛查 治疗方案的规划与调整，如耐药检测，分型检测,3,HIV感染过程中的病原学及免疫学标志物,HIV实验室检测的病原学基础,4,法国巴斯德研究所Montagnier和美国人类病毒学研究所Gallo分离并鉴定，因该项成就Montagnier等人获2008年度诺贝尔奖。,5,病毒颗
2、粒基本结构 Core核心: Viral nucleic acid (DNA or RNA) Capsid衣壳: Protein shell Core + Capsid = nucleocapsid (核壳体） Envelope包膜： Spike刺突,Naked virus：裸露病毒: Nucleocapsid = virion. Enveloped virus：包膜病毒: Nucleocapsid + Envelope = virion Special structure：特殊结构: e.g. 逆转录酶,RBC直径约为10000 nm,HIV 基因组结构及编码蛋白特征,启动转录,核心蛋白 （核
3、壳膜）,编码代谢酶,编码受体 结合蛋白,9200 bp,结构基因,env基因：gp120，gp41 gag基因：p17，p24,功能基因：,pol基因：逆转录酶，蛋白酶，整合酶,功能辅助基因：调节结构基因、功能基因转录与表达 Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，Nef,HIV基因组,7,Env刺突由3个gp120亚单位非共价连接，与3个gp41亚单位形成的异源性三聚体蛋白位于病毒颗粒的外侧。 Gp120与CD4结合后，暴露辅受体结合位点，gp120与辅受体CCR5和CXCR4结合 Gp41介导病毒颗粒与细胞膜的融合，将核壳体释放到靶细胞内。 病毒逆转录酶 介导RNA逆转录成cDNA，通过核
4、孔转移至细胞核，形成整合前复合体。 病毒整合酶 催化HIV基因组整合到人体染色体上。转录形成病毒mRNA。病毒mRNA转移出细胞核，翻译成病毒蛋白。 Gag蛋白，病毒基因组RNA，env糖蛋白复合体，以及GagPol前体蛋白组装病毒颗粒发生于浆膜侧。Gag蛋白上的顶端正电碱性片层，引导Gag定位与浆膜上的磷脂酰肌醇结合区。 病毒蛋白与病毒基因组mRNA组装成新病毒颗粒。伴随新病毒颗粒的释放，病毒蛋白酶 清除Gag和GagPol多聚蛋白前体，导致病毒颗粒成熟和释放。,HIV env基因编码包膜糖蛋白的基本结构,9,图1. env蛋白的三聚体结构及其光谱中和表位的分布.,M.J. van Gils
5、, et al. Virology 2013;435: 4656,HIV入侵细胞基本机制,Klasse PJ. Cellular Microbiology 2012;14:11831192.,HIV包膜蛋白细胞内穿行与病毒颗粒的组装,J Mol Biol 2011;410:582-608,HIV组装 基本机制,蛋白酶抑制剂作用靶点,J Bio Chem 2012;287:40867-40874,Nature 2011;469:424-427,HIV感染过程中的病原学及免疫学标志物,HIV感染后病毒学参数变化特征,HIV感染后感染后，血液中最早可以检测的标志物是HIV RNA和p24抗原。其中病
6、毒RNA最早可以在感染后2周内检出。 随后滴度逐渐增加，在感染后的2个月可以高达200万拷贝/毫升血浆。 同时出现体液和细胞免疫反应。这些免疫反应可以控制HIV复制，并可以大幅度降低RNA水平，使RNA水平达到一个恒定的水平，即所谓的调定点。 根据这个调定点的水平可以预测随后感染的病程特征：调定点水平越高，疾病进展就越迅速，就会越快进展到AIDS。相反，调定点水平越低，疾病的进展就越缓慢。 在感染的后期阶段，RNA水平再次逐渐增加，并在AIDS相关症状出现时再次达到一个很高的水平,14,某公司试剂检测HIV/AIDS，相应标志物的变化特征,AIDS实验室检测基本方法,诊断性检测,初筛实验：IF
7、A、ELISA:1985第一代试剂开始使用 确认实验：Western blot，线性印迹,预后判定性检测,T细胞亚群检测：流式细胞仪技术 HIV RNA检测：几种核酸技术,HIV耐药检测,表型耐药：细胞培养技术 基因型耐药：序列测定，杂交技术,16,初筛实验：双抗体夹心ELISA的基本原理,HIV ELISA诊断试剂的历史沿革,18,19,HIV/AIDS快检试剂,原理：乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析，金标法最多，可进行全血、血清、以及尿液检测 特点：费时短、不要求特殊设备、适用于应急和基层使用，最大缺点是价格高，敏感度和特异度低于EIA，不适于城市内的血液筛查。,20,确认实验：Western
8、 blot基本流程,美国CDC：2条带应该分别是gag和env基因产物 WHO：可以是env基因产物两条带 美国红十字会：应该至少gag, env, pol基因各显示1条带,确认实验 结果判定,22,一旦确诊感染HIV，重要的是对病情进行监控，并给予合理抗病毒治疗，以延缓病情的进展。 病毒抗原检测最早用于预后判断，但目前已经基本被CD4检测缩替代，观察P24抗原应该考虑到晚期表达水平下降的问题。 病毒载量检测 直接评估 HIV-RNA 常用的方法包括 RT-PCR, NASBA, 以及 bDNA. 是目前常用的技术。 T细胞亚群检测是目前判定患者预后及决定治疗方案的重要方法。,预后判定检测,2
9、3,T细胞亚群检测的病理依据及意义,数量下降： 细胞毒素和自然杀伤细胞引起。 外周细胞凋亡, 未分化细胞死亡。 淋巴腺空泡和特殊的凋亡。,功能丧失： 分布外周血中的在幼稚和记忆和其它未知功能细胞变化导致免疫反应削弱。,评价免疫功能减退的程度和AIDS进程 指导治疗策略的制订 确定预防机会感染的最佳时机 监控抗逆转录病毒（ARV）治疗、细胞因子治疗和保护治疗性疫苗的疗效,24,25,液流系統 利用鞘液（FACSFlow Sheath Fluid）將細胞依序送至測量區受檢 光學系統 利用雷射光源、透鏡、光柵、濾片與反射鏡等激發並收集細胞產生之螢光與散射光，並導至各探測器內 電子系統 1.將探測器測
10、到的光學訊號轉換為電子訊號 2.分析所輸出的電流訊號，以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示 3.量化並放大訊號傳至電腦,流式細胞儀的基本組成,26,BD FACSCaliburTM 多色分析仪,Dichroic Mirrors,Bandpass Filters,Detector#1,Detector#2,Detector#3,Detector#4,CD3,CD19,CD45,CD14,CD14,CD14,CD16/CD56,31,Suppressor T cell,T cell / B cell,CD45 PerCP,SSC,流式细胞仪T细胞亚群绝对计数原理,MMWR, 2003:
11、 52(RR02);1-13,32,RT-PCR bDNA NASBA LCx,HIV RNA检测的方法,RT-PCR、NASBA检测属于PCR方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以较容易受污染，而使RNA降解 bDNA与RT-PCR、NASBA相比较有较好的稳定性、线性和可重复性,特殊人群：怀疑急性期感染者，母婴传播，核酸检测能够提供早于免疫学指标的诊断，已经被认为是18个月以下婴幼儿诊断的金标准。 除早期诊断外，HIV RNA测定能够监测HIV慢性感染者病情的发展。 以及作为评价HAART治疗效果的评价指标。 应用核酸杂交法或应用PCR法检测HIV的前病毒DNA可确定细胞中HIV潜伏感染情况
12、。 由于其固有的高敏感性，某些国家已经采用这种技术用于献血员的筛查，被认为与经典免疫学筛查方法相比，可以降低输血传播约50%。,33,NASBA 技术,NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) 早期产品为NASBA HIV-1 RNA QT定量RNA测定方法，现已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT assay取代。 NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶，以在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。,Triton X-100裂解病毒提取核酸
13、加入铷标记的内标 电化学发光检测 根据内标计算野生株拷贝数,34,RT-PCR 技术,基本原理是通过逆转录酶的作用将样品中RNA逆转录合成DNA后进行聚合酶链式反应（RT-PCR），方法较为简单 异硫氰胍裂解液裂解病毒，释放出核酸成分。 加入一个已知拷贝数量的合成RNA分子作为定量标准（QS），然后进行RNA提取。 使用引物在逆转录酶的作用下逆转录产生142碱基的gag基因片段（DNA），通过PCR方法对此基因片段进行扩增。 清洗掉未杂交的反应产物后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，亲和素与扩增产物上的生物素结合 HRP的底物进行显色反应，测定OD值。,35,bDNA 技术,bDNA
14、测定技术基于其独特的信号放大系统，即bDNA信号放大系统，这是一个人工合成的bDNA，bDNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应 首先将血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，HIV RNA释放后加入微孔板中 板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针，靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与bDNA结合，加入酶标记物对结合的bDNA进行标记 经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度,本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。,36,HIV RNA
15、应该在感染后从血清转换至AIDS 全程可以检测地到。但实际感染者中许多血清HIV RNA 水平并不高，有些患者在无症状阶段甚至低于400 拷贝/毫升。 对于一些敏感性不高的试剂盒，该阶段可能会出现HIV RNA 检测阴性的结果。 其它一些因素也会影响检验结果的准确性,地理因素感染亚型和循环中病毒重组的影响 病毒变异导致扩增引物特异性变化 病毒准种复杂性,HIV RNA检测结果解读注意事项,37,近期HIV感染患者的识别:STARSH分析,新近感染的识别有助于HIV传播模式的评价 新近HIV血清学转换测试算法（STARSH）是一系列分析方法 这些分析方法主要是基于HIV感染后一系列典型的免疫学事
16、件 这些分析方法一旦在HIV特异性抗体生成，并不能鉴别哪些患者是慢性感染者，哪些是新近感染者,总体评价,38,近期HIV感染患者的识别:STARSH分析,常用方法,“失调”分析（detuned assay） 该技术基于HIV感染早期阶段诱导机体所产生的抗体亲和力和滴度都比较低，而随着疾病的进展，HIV特异性抗体的亲和力和滴度都逐渐升高。因此，联合一种高敏感试剂盒和相对低敏感试剂盒对标本进行分析即可达此目的。 BED-捕获酶免分析（CEIA） BED-捕获酶免分析是一种商用产品，其原理是基于HIV-特异性IgG抗体占血清总IgG抗体比例，藉此推断感染大致时间。早期感染，HIV特异性IgG占总Ig
17、G比例较慢性感染低，并随着感染时间延长而逐渐增加。,39,近期HIV感染患者的识别:STARSH分析,常用方法,亲和指数分析 这种方法是基于HIV感染越早，HIV抗原与诱导产生的抗体亲和力越低的事实。基于抗原-抗体的亲和力指数对感染时间进行判定。具体来说，将患者的血清标本首先采用离液剂，诸如盐酸胍，断开维持抗体二级结构及与抗原相互作用的氢键。然后重新对抗体亲和性进行分析。 IDE-V3免疫分析 IDE-V3免疫分析是一种基于env编码糖蛋白上的两个保守的免疫表位：一个表位在gp41上，另一个表位在gp120上的V3区。根据不同寡肽的抗体亲和模式，可以将感染分为180内的感染和180天后的感染,
