核酸代谢3--转录与加工2011

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1、核酸代谢,第三部分：RNA的生物合成 （章节：8.3.2）,8.3.2RNA的生物合成-转录,掌握原核生物转录的基本过程和参与转录的相关因子的功能 理解真核生物转录和原核转录的异同，掌握真核生物mRNA转录后的加工过程 了解tRNA和rRNA的转录后加工过程。 重点、难点：RNA的转录过程和转录相关因子的功能；真核mRNA转录后的加工过程；RNA转录后的加工与修饰。,目的要求,RNA合成两个方式：转录、RNA的复制（某些病毒） 转录（transcription）：在RNA聚合酶催化下, 以一段DNA为模板合成出对应RNA的过程。 （在DNA指导下合成RNA。） 转录产物有mRNA 、rRNA、

2、 tRNA和小RNA。 除某些病毒基因组RNA外，生物体内绝大多数 RNA分子都来自DNA的转录产物。,复制与转录的比较 相同：要有模板， 新链延伸方向5 3， 碱基的加入遵循碱基配对原则。 不同：复制需要引物，转录不需引物。 转录时，模板DNA的信息全保留 复制时模板信息是半保留。 RNA聚合酶只有5 3聚合活性， 无5 3及3 5外切活性。,转录起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一 特定位点终止。此区域称为一个转录单位。 转录的起始由DNA上的启动子区控制，DNA上的 终止子控制转录的终止。 一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以 是多个基因（原核）。 Gene是遗传物质的最小功能

3、单位，只相当于DNA 的一个片断。,转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。 基因表达的产物：RNA 蛋白质 DNA正链：与mRNA序列相同的DNA链（有意链Sense strand ）。 负链：与正链互补的DNA链（模板链）（与mRNA序列相同,仅T、U互换）Antisense strand 转录起点核苷酸为+1 起点右边为下游（转录区），用正数表示。 转录起点左侧为上游，用负数表示：-1，-2，-3。,Fig. Sense strand and Antisense strand,转录的特点： 1）基因的转录是局部转录 2）基因的转录有选择性 细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转

4、录不同的基因。 3） 转录是不对称性的 不对称转录有两方面的含义： 一是 DNA一条单链可转录，另一条单链不转录； 二是 模板链并非永远在同一单链上。,Fig. Template strands,8.3.2.1RNA聚合酶,RNA合成的基本特征： 底物（ATP、GTP、CTP、UTP）NTP RNA链延伸方向5 3，RNA聚合酶无5 3及3 5外切活性 不需要引物 需要DNA模板,1. E.coli RNA聚合酶（原核） E.coli和其它原核细胞一样，由一种RNA聚合酶合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。 一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任何时刻，大部分聚

5、合酶（5000左右）正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。 RNA聚合酶分子量46万Da，由六个亚基组成，2及2个Zn2+。 因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与2分离。,无亚基的酶（2）叫核心酶。 核心酶(core enzyme)只能使已开始合成的RNA 链延长，而没有起始合成活性，加入亚基后， 全酶才具有起始合成RNA的能力。 亚基的功能：核心酶在DNA上滑动，亚 基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留 时间，使全酶迅速找到启动子并与之结合，亚 基自身无催化活性。,五种亚基的功能分别为： 亚基：与启动子结合功能。 亚基：结合NTP和新生RNA链，含催化部位，起催化作用，

6、催化形成磷酸二酯键。 亚基：与DNA模板结合功能。 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。 亚基：识别起始位点。 不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但亚基有所差别，识别不同的启动子，从而表达不同的基因，决定了原核基因表达的选择性。,RNA聚合酶,图 RNA聚合酶,核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分 17bp左右，RNA-DNA杂合链约10bp。 纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链 DNA。解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内 在特性，在酶的前端解螺旋，在后端重新螺旋 化。活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助 调整DNA拓扑学性质。 37时，反应速度可达40核苷酸/秒。,图：RNA聚

7、合酶的催化活性,核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分17bp左右，RNA-DNA杂合链约10bp。 RNA聚合酶，还可在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化。,2. 真核生物RNA聚合酶 真核生物的转录机制要复杂得多，三种RNA 聚合酶，在细胞核中起不同的作用。 依其对-鹅膏蕈碱的敏感性，可分为三种。 分类、分布及各自的功能见表：,真核细胞的RNA聚合酶,酶类,分布,功能,-鹅膏蕈碱 对酶的作用,I,核仁,核质,核质,rRNA,mRNA,tRNA 5SrRNA,不抑制,低浓度抑制,高浓度抑制,1. 起始（initiation）,RNA聚合酶全酶扫描，与启动子结合，在局部解链区找到

8、起始点，然后结合第一个核苷酸，即启动子、全酶和核苷酸形成三元起始复合物。加入的第一个核苷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。第一个核苷酸一旦掺入到转录起始点，亚基就会被释放脱离核心酶。,因子仅与起始 有关，RNA的合 成一旦开始，因子便被释放。,8.3.2.2基因转录过程-由RNA聚合酶催化,2. 延长(elongation) 亚基离开核心酶，使核心酶的亚基构象 变化，与DNA模板亲和力下降，（亚基与 结合时，亚基的构象有利于核心酶与启动 子紧密结合）在DNA上移动速度加快，使RNA 链不断延长。 3. 终止（termination） RNA聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子

9、的帮助下，RNA链和聚合酶脱离DNA链。,转 录 过 程,4、启动子和转录因子,启动子（promoter）：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。 转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质称为转录因子。,a. 原核启动子结构与功能 启动子都存在保守序列，包括RNA聚合酶识别和结合位点。 （1）-10序列（Pribnow框） 转录起点上游约-10处,6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow box。 出现在- 4到- 13bp之间，每个位点的保守性在 45%-96%。,目前认为，Pribnow box决定转录方向。酶在此部位与D

10、NA结合形成稳定的复合物，是RNA聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。 RNA聚合酶结合后，诱导富含AT的Pribnow box的双链解开，然后进一步扩大成17个核苷酸长度的泡状物，在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。,（2）-35序列（Sextama box）（识别区域） 只含-10序列的DNA不能转录，在-10序列上游还有一个保守序列，其中心在-35位置，称为-35序列(TTGACA)，此序列为RNA聚合酶识别区域。 各碱基出现频率：T85 T83 G81 A61 C69 A52 。 其中TTG十分保守。 -35序列的功能：它是因子的初始识别位点。因此，-35序列对RN

11、A聚合酶全酶有很高的亲和性。-35序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。,-35序列提供RNA聚合酶识别信号。 -10序列有助于DNA局部双链解开。 启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 与保守序列接进的启动子较强，反之则弱。 不含-35序列的启动子几乎不转录。 不同的因子识别不同的启动子。,图：启动子共有序列的功能,Pribnow box（-10区）：RNA聚合酶牢固结合位点，此处AT含量多，是DNA双链局部解开位点。 Sextama box(-35区)：RNA聚合酶识别位点，该序列提供了RNA聚合酶识别的信号。,b 真核启动子,真核基因的转录十分

12、复杂，启动子有三类，分别由 RNA聚合酶、和进行转录。 类别启动子 可被RNA聚合酶识别， 只控制rRNA前体转录 类别启动子 可被RNA聚合酶识别， 由基本启动子、起始子、上游元件和应答元件组成。,RNA 聚合酶识别类别启动子，转录mRNA。 基本启动子 A. TATA框 （Hogness box） 中心-25至-30，长度7bp。 频率：T82 A97 T93A85 A63 （A37 ）A82 A60（T37 ） 功能： DNA双链解开，并决定转录的起点位置， 失去TATA框，转录将可能在许多位点上开始。,TATA框的改变或缺失，直接影响DNA与酶的 结合程度，使转录起始点偏移。因此，TA

13、TA是 许多数真核基因正确表达所必需的。 由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构， 同TATA框的结合位点和转录反应催化位点的距离，决定了起始位点的正确选择。 启动子特定序列和酶的正确结构，这两者把酶置于一种正确的构象中，决定了识别的正确性和转录起始的正确性。,B. CAAT框 中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G） CAATCT 功能：与RNA聚合酶结合。 可与CTF结合，控制转录起始活性。 CTF: CAAT-binding transcription factor C. GC框（ GC island） 在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录 因子结合，CAAT和GC框均为

14、上游因子，对转录 的起始频率有较大影响。,真核启动子区,类别启动子 RNA聚合酶识别的启动子，转5SrRNA、 tRNA和胞质小RNA（scRNA），在转录区内 部。 核内小RNA（snRNA）的启动子在转录起点 上游。,5、终止子和终止因子,提供转录终止信号的一段DNA序列称为终止子(terminator) 。 协助RNA聚合酶识别终止子的辅助因子称为终止因子（属于蛋白质）。 有些终止子的作用可被特异的因子阻止，使酶越 过终止子继续转录（通读）。这类引起抗终止作 用的蛋白质称为抗终止因子。 终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被 RNA聚合酶或其辅助因子识别。,（1）强终止子-不依赖于

15、的终止子 具有发夹结构及polyU。回文对称区富含G.C， polyU可能提供使RNA聚合酶脱离模板的信号。 （2）依赖的终止子 必需在因子存在时才能引发终止，回文结构 不富含G.C，无polyU结构。 因子： 55000蛋白质，可水解三磷酸核苷。 因子能与RNA聚合酶结合但不是酶的组分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移动，于是转录终止，并释放出已转录完成的RNA链。 通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。,终止子,8.3.2.3 RNA转录后的加工,转录后加工：RNA聚合酶合成的原初转录产物，经过剪切、修饰、拼接等过程，转变成成熟的RNA分子。,1、mRNA前体的加工： 原核生物mRNA

16、转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。亦有少数多顺反子的mRNA需要核酸酶切成小单位，然后再翻译。 真核生物mRNA（半寿期较长）原初产物很大，被称为核内不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，需要进一步进行加工修饰转化为mRNA。,真核生物mRNA加工顺序： 5端连接“帽子”结构 3端切除，添加polyA “尾巴” hnRNA被剪接，剪掉内含子（introns），拼接外显子（exon) 分子内部的核苷酸甲基化修饰 RNA编辑（RNA editing）,3端切除，添加polyA “尾巴”,mRNA的剪接（Splicing),多数真核基因是不连续的、断裂基因（interrupted gene)，其转录产物需要剪接。mRNA的剪接包括3 种类型： 类型 I 自我拼接 类型 II 自我拼接 mRNA前体的拼接,