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1、,第七章 外源基因的表达及其优化策略,第一节 影响外源基因表达的因素 第二节 外源基因在原核细胞中的表达 第三节 外源基因在真核细胞中的表达,本章重点掌握内容,基因表达的关键要素及要求 影响外源基因表达的因素 表达产物的纯化 甲醇酵母表达系统,第一节 影响外源基因表达的因素,基因表达： 从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子和反密码子系统，转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中，基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表
2、达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。,基因表达 遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程。,中心法则 central dogma,克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞,一、影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系,（一）阅读框架(open reading frame)对外源基因表达的影响 （二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响 顺式作用元件是转录调节因子结合位点，如启动子、增强子和沉默子 1.对基因转录起始的调控 2.对基因转录终止的调控 3.对DNA结构的影响,（二）顺式作用元件
3、(cis-acting element)对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子 ：RNA聚合酶及转录起始点周围的一组转录控制组件 TATA box GC box CAAT Box 提高转录准确性与频率 2)增强子：远离转录起始点（上游或下游）、决定组织特异性表达、增强启动子转录活性的特异DNA序列 3)沉默子：负调节元件，对基因转录起阻遏作用,（二）顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 ：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 2)衰减子：操纵子的前导区(操纵子内开始转录到结构基因编码开始位置之间的一段DNA)内类似于终止子结构的一段DNA序列
4、3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区 ：造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性 2)绝缘子 ：阻止临近调控元件，对所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用 3)基因座控制区：以组织特异性及拷贝数依赖的方式将相关基因的表达增强到生理学水平的异位染色质位点,（三）翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响 （四）表达系统对表达产物的影响,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。,宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类
5、为真核细胞： 酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。,用原核生物作宿主。,A dividing E. coli,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间
6、构象不正确的异源蛋白 真核与原核生物结构上存在差别,一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。,一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。,转录和翻译偶联、连续进行,一、原核生物细胞表达的特点 6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列。 Shine-Dalgarn
7、o（S-D）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,二、外源基因在原核细胞中表达具备条件 1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。 2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。 3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。 4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。 5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,原核生物基因表达
8、载体的组成特征 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子 原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统,大肠杆菌表达载体的基本成分,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 （1）启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,-35 Box 和 -10 Box,不同启动子的consensus sequences,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列 -35box：RNA聚合酶 亚基的识别位点
9、。 5-TTGACA-3 -10box（Pribnow Box）：5-TATAAT-3,原核启动子共有序列的功能,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 S-D序列距离AUG的距离也影响翻译 b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）,三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种
10、类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 原理： 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 多聚A/U 由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子,三、原核生物基因表达的调控 4. 翻译终止密码 大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部
11、的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。 5. 翻译增强子（Translation enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段,四、常用大肠杆菌表达载体,1. 非融合型表达载体,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成：
12、1）强启动子: tac（trp-lac） 2）操纵基因：乳糖操纵子系统。,trp的-35区,lacUV5的-10区,lac操纵基因,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。 4）终止子：rrnB的强终止子 S-D序列和插入位点区：,Lac I,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 6）载体的其余部分：来自pBR322质粒。 7）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK2
13、23-3 载体：,条件： 必须选择一个有lacI的宿主菌。,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 pIN III系列 组成结构 1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 2）调节基因：lac I 。 3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。,pIN II
14、I-comA1,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 如：pGEX系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。 组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,产物提纯:,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白
15、表达载体系统 pGEX系列 产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,pGEX-2X的插入区,pGEX-1X的插入区,pGEX-3X的插入区,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统,pGEX系列插入区,四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签） 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式,位于,细胞质,细胞周质,细胞外,表达产物,形式,包涵体蛋白,融合蛋白,整合型外源蛋白,分泌型外源蛋白,细胞质
16、中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会 发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。 包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚 集折叠而成的晶体结构物。,蛋白质的合成是在细胞之中进行的 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总 蛋白的20%40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于 本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分 泌到周质空间，或外泌到培养液中。,周质中表达： 周质：在大肠杆菌一类革兰氏阴性菌中，位于内 膜和外膜之间的细胞结构部分。 在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细 胞质中穿过细胞质内膜进入周质。,胞外表达： 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质， 分泌到胞外培养基中进行分离纯化。,途径： 1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分 泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特 别有效的程序） 2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏， 导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。 （可以分离到中等产量的蛋白质）,
