《基因工程药物设计与研制方法2012》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程药物设计与研制方法2012（32页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章 基因工程药物设计与研制方法,第一节 重组蛋白药物的复制,预测全球生物仿制药市场在2014年可高达一百 九十四亿美元。,现有的生物制剂专利很大一部分即将过期，到2016年，约有250亿美金份额的生物制剂将失去专利保护。 新的生物药不断获得批准，预测2010年批准的新药中将有1/3是生物药。,重组蛋白药物开发约需10亿美元。,组织,细胞,目的基因的克隆,表达系统的选择和建立,稳定细胞系的建立,蛋白的高效表达,药物蛋白的纯化,体内和体外的检测方法的建立,表达细胞的工业化培养,药物蛋白大规模纯化技术,质量控制,临床试验,市场开发,一、复制生物技术药品的一般技术流程,实 验 室 阶 段,工 业
2、化 阶 段,二、复制重组蛋白药品存在的问题,（一）复制非专利生物药品的困难,蛋白质的高级结构难以复制。,药效和安全性难以与原药品一致。,（二）复制蛋白药物的主要问题免疫原性,蛋白药物免疫原性还包括：分子多聚体、 污染物、分解片段等。,免疫原性与患者、治疗流程、制备工艺有关。,开发周期较长，注册仍需要临床试验。,（三）产生抗体的后果,多数情况无临床后果。,有时可能提高药效。,少数免疫原性太强，导致药品无法使用。,抗体还可能与内源因子反应，导致药品 禁止使用。,（四）预测蛋白药物的免疫原性的方法,现有的抗原决定簇公式难以预测免疫原性。,抗血清筛选不能完全说明该抗体就是由药物 蛋白激发。,同一种蛋白
3、的转基因小鼠可以较好预测药物 蛋白的免疫原性。,第二节 通过对现有药物的优化和改造研发新药,一、定向突变,采用随机的基因突变或基因重组技术与定向的突变体筛选方法相结合的分子进化技术。,自然界进化：先突变后选择。,基因工程加速了进化历程。,基因工程一般预先知道突变结果。 根据已有基因的序列和功能进行设计，称为理性设计。,定向突变模拟自然进化方法，首选让基因发生随机 突变，通过筛选系统进行定向筛选或选择。 预先不知道基因或蛋白质序列，称为非理性设计。,定向进化技术的三个步骤,制备突变体文库。,突变体文库在适当的表达系统内表达。,筛选突变体。,（一）易错PCR,是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时
4、，通过调整反应条件来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。,提高镁离子浓度。 加入锰离子。 改变体系中的dNTPs浓度。 运用低保真度DNA聚合酶等。,增加碱基错配的方法,易错PCR的概念,易错PCR成功的关键,选择合适的突变频率。 一般目的基因突变1.5-5个时，诱变结果理想。,嵌套易错PCR，使其PCR错误积累。,（二）DNA或基因改组(DNA shuffling),以单个基因或多个同源基因为模板，将其切割成一系列随机大小的DNA小片段，然后在体外通过聚合酶链式反应将这些片段随机重组成全长基因，实现同源基因重组，达到分子进化目的的一
5、种技术。,DNA或基因改组也称分子育种或有性PCR,DNA Shuffling的基本步骤,Dnase或超声波将模板产生DNA片段； 随机片段变性； 随机片段复性； 延伸； 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段。,实例：随机挑取枯草杆菌蛋白酶DNA 重组装库中10个克隆序列。,DNA Shuffling的引物如何设计？,酶切片段之间互为引物和模板，无需特别设计引物。,DNA Shuffling为什么发生crossover，从而得到 全长基因？,Parental sequence(s)是一个还是多个？,多个parental sequences成功率会提高。,DNA Shuffling的基本原理
6、,这是重叠延伸的结果。,相关基因组（parental sequences）相似程度； 酶切产生的DNA片段大小及内切酶种类； 退火温度及PCR反应条件； 突变频率控制在适度范围内。,DNA Shuffling成功的关键因素,1、随机引物引发体外重组,在模板DNA存在的条件下，随机引物、短暂 PCR反应，得到一组DNA片段。,移去模板DNA，再PCR扩增。,2、交错延伸技术,在有引物的情况下，缩短PCR延伸的时间、退火温度不合适，得到一条延伸不完全的链。,上一轮的延伸产物作为引物，再次不完全延伸。,上述步骤反复进行，得到一组DNA片段,DNA Shuffling的改进,（三）大肠杆菌突变株用于定
7、向突变,大肠杆菌缺少一种DNA修复酶，容易产生DNA突变。,（四）盒式诱变,将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代。,盒式诱变基本步骤,目的基因插入载体，并在目的基 因中引入限制酶位点。,酶切载体。,人工合成的片段连接到载体上。,二、定点突变,定义：是指通过PCR等方法对已知的目的基因DNA片段进行碱基的添加、删除、点突变等，从而改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。,特点： 突变位点是确定的； 突变的个数也是预知的； 突变的效应往往是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。,（一）寡核苷酸引物诱变,使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作
8、引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成DNA子链的一个组成部分。,复习m13,寡核苷酸引物诱变过程,M13正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选,提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法,Dut-缺陷，导致dUTP 可掺入 DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。 ung 缺陷，不能除去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基。,在ung 缺陷和Dut-缺陷的大肠杆菌中制备，含U的DNA。,感染 dut+ ung+ E.coli，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链
9、DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作用下，尿嘧啶被水解，从而失去作为模板的能力。,已知有些限制酶不能切割硫代磷酸DNA分子。,硫代磷酸诱变法,在异源双链DNA分子制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变链中。,然后用前述酶切割，并用外切酶局部消化后，进行聚合反应，从而产生具有定点突变的异源双链DNA。,第三节 创新药物设计,一、通过筛选同源基因的方法。,二、通过RNA的表达谱。,检测患者的特异性基因表达,三、蛋白质组学。,四、使用寡核苷酸技术。,干扰RNA,五、基因功能系统分析。,建立不同表型细胞模型，预测新基因功能。,六、使用生物模型。,http:/www.n
10、cbi.nlm.nih.gov,Blast方法,M13噬茵体载体,(1) M13噬菌体的组成和结构,噬菌体颗粒是丝状的。,感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的 细胞中分泌出噬菌体颗粒，能够抑制宿主细 胞生长和分裂。,只感染雄性大肠杆菌。,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成。,单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上序列可编码蛋白质，共有11个编码基因。 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。,（2）M13噬菌体的基因组,编码3类蛋白质： 复制蛋白（基因，和）。 形态发生蛋白（基因，和）。 结构蛋白（基因、
11、和）。,复制蛋白（基因，和）。,形态发生蛋白（基因，和）。,（3）M13噬菌体的复制,以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链， 该双链称复制型DNA（RFDNA）。 RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个 细胞约200个拷贝。 单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，阻断了 （）链的合成，（+）链DNA仍然不断的合成。,（+）链DNA从细胞膜溢出，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。,（4）M13噬菌体载体的构建,M13噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。,M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA，单链DNA的酶切和连接是比较困难的。,只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因/和基 因/之间）。,
