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1、标记免疫技术的原理与应用,临床免疫学教研室李会强,2,医学免疫学与临床医学,免疫预防与免疫治疗免疫诊断（实验室诊断）,3,免疫技术与临床医学,肥达氏反应 用于检测伤寒患者血清中抗体，最早血清学实验方法；放射免疫分析技术 测定体内微量物质含量，推动内分泌学科发展；,4,免疫学检测技术,经典抗原抗体反应标记免疫技术,5,标记免疫技术,标记免疫技术可视为用不同的示踪物质与抗原抗体反应结合的微量检测技术的总称，它具有较高灵敏度和较高特异性。不仅应用于临床检验医学，同时也为基础医学的发展作出了巨大的贡献。,6,课程安排,36学时（全部理论课）分析原理临床应用,7,参考教材,临床免疫学检验（第二版）吕世静
2、 主编医药科技出版社,8,本章内容,基本概念和基础知识 标记免疫技术发展简史 标记免疫技术的基本理论 标记免疫技术的特点及局限性 标记免疫技术的应用,9,本章内容,基本概念和基础知识 标记免疫技术发展简史 标记免疫技术的基本理论 标记免疫技术的特点及局限性 标记免疫技术的应用,10,基本概念和基础知识,抗原分子,11,基本概念和基础知识,抗体分子,12,基本概念和基础知识,抗原抗体反应 抗原表位与抗体超变区空间结构互补奠定分子间的特异性结合;抗原与抗体间的作用力,使之形成稳定免疫复合物,并呈现一定现象;,13,基本概念和基础知识,14,基本概念和基础知识,抗原抗体反应 物质基础 抗原分子表面的
3、抗原表位与抗体分子的抗原结合部位之的空间互补性。,15,基本概念和基础知识,抗原抗体反应 相互作用力 氢键 范德华力 静电引力 疏水键,Fig：抗原抗体间相互作用力,16,基本概念和基础知识,抗原抗体反应 反应特点 特异性 可逆性 比例性,17,基本概念和基础知识,抗原抗体反应 反应特点 特异性 可逆性 比例性,18,免疫亲和层析纯化蛋白质,19,基本概念和基础知识,抗原抗体反应 反应特点 特异性 可逆性 比例性,Fig：抗原抗体需最佳比例,20,基本概念和基础知识,标记免疫技术 将抗原或抗体用示踪物质（同位素、荧光素）进行标记，形成标记抗原或标记抗体。用已知的标记物与待测的抗原或抗体反应，反
4、应形成的复合物后，通过检测反应体系中的标记物，对待测物质进行测定。,21,基本概念和基础知识,标记免疫技术 荧光标记免疫技术 同位素标记免疫技术 酶标记免疫技术 胶体金标记免疫技术 发光免疫技术 流式细胞术,22,基本概念和基础知识,标记免疫技术的地位 标记免疫分析以其较高的灵敏度、特异性、以及操作简便快速，使其在现代化检验中占有重要的地位，是医学、生物学研究和临床诊断的重要手段。,23,基本概念和基础知识,标记免疫技术的地位 标记免疫技术应用于临床检验，已广泛的应用于生物活性物质、激素、维生素、药物、微生物检测的主要方法。其在免疫学、内分泌学、病原体检测、肿瘤标志物的检测等方面占有重要的地位
5、。,24,本章内容,基本概念和基础知识 标记免疫技术发展简史 标记免疫技术的基本理论 标记免疫技术的特点及局限性 标记免疫技术的应用,25,发展简史,1941年 采用FITC标记抗体，检测小鼠组织切片中的可溶性肺炎双球菌多糖抗原（Coons）。1950年建立了用放射性碘标记抗原的方法（Pressman和Eison）。,26,发展简史,1959年Yalow和Berson完成胰岛素的放射免疫分析，并创立放射免疫分析方法；,Rosalyn Yalow,The Nobel Prize in Physiology or Medicine,27,发展简史,1960年Ekins创立甲状腺素竞争性蛋白结合分析
6、法。其后，Ekins对标记免疫分析的诸多理论，如标记免疫分析的剂量反应曲线的数学模型、数据处理、灵敏度以及试验设计等均有重要的贡献；,28,发展简史,1963年Hunter和Green Wood建立了氯氨T碘标记法；1967年Catt建立固相放射免疫分析法； 1968年Mile和Hale创立免疫放射分析法 ( immunoradiometric assay，IRMA )；,29,发展简史,1970年Lefkowitz建立放射受体分析法（radioreceptorassay，RRA）；1971年Addison建立双位点夹心放射免疫分析；,30,发展简史,1971年Engvall和van Weem
7、an建立酶联免疫吸附试验法（ELISA）； 1973年Rubenstein建立均相酶免疫分析法； 1974年Rodbard建立RIA和IRMA数据处理的数学模型；,31,发展简史,1975年Kohler和Milstein建立了用杂交瘤制备单克隆抗体的方法。1980年单克隆抗体正式引入放射免疫分析和酶免疫分析中，为非竞争性标记免疫分析的发展提供了必要的条件。,32,发展简史,1976年Schroeder建立生物发光免疫分析法； 1977年Greenwood建立Digoxin的RIA全自动分析方法，其中用磁颗粒分离方法为以后全自动化的时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析所引用；,33,发展简史,
8、1978年Halman建立化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）；1981年Ngot建立均相底物标记荧光免疫分析法；,34,发展简史,1982年Meurman建立时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay,TR-FIA）； 1986年Octell将亲和素-生物素系统（ABS）引入IRMA技术中；,35,发展简史,1991年Ekins建立抗体微点免疫分析（micro-point immunoassay），现称为微阵列免疫分析（micro-array immunoassay）；,36,本章
9、内容,基本概念和基础知识 标记免疫技术发展简史 标记免疫技术的基本理论 标记免疫技术的特点及局限性 标记免疫技术的应用,37,基本理论,抗体占位原则 当探测抗体（又称传感器抗体），进入含分析物的溶液时，被分析物占据结合位点，其结合反应在某种意义上受平衡常数的控制。最终游离分析物的浓度取决于总抗体浓度和总分析物浓度。,38,基本理论,抗体占位原则 质量作用定律： AgAb / fAb = K fAg 如按抗体结合位点的部分占有率，则表示为: AgAb / Ab = K f Ag / （1 + K fAg ）,39,基本理论,竞争性分析与非竞争性分析 所有的标记免疫分析都依赖于测量抗原-抗体反应后
10、，分析物与抗体结合的部分占有率（fractional occupancy）。根据测量的部分不同，可将标记免疫分析分为竞争性分析和非竞争性分析两大类。,40,基本理论,竞争性分析与非竞争性分析 凡基于测量非分析物占有的抗体结合位点的技术（测量游离的标记物，主要是标记抗原），称为竞争性分析。 凡基于直接测量由分析物占有的抗体结合位点的技术，称为非竞争性分析。,41,基本理论,竞争性分析 如果标记抗原和非标记抗原对同一抗体有相同的亲和力，则二者在同一反应系统中就会与特异性抗体发生竞争性结合。,42,基本理论,竞争性分析 将标记抗原和待测抗原置于同一反应体系中与定量抗体发生反应，则二者会与特异性抗体发
11、生竞争性结合。,43,基本理论,竞争性分析,44,基本理论,竞争性分析,45,基本理论,竞争性分析 剂量反应曲线,46,基本理论,非竞争性分析 通常将抗体进行标记，制备成标记抗体；过量的标记抗体与待测抗原反应。,47,基本理论,非竞争性分析,48,免疫分析技术,均相免疫分析非均相免疫分析,49,均相免疫分析,PROTOCOL Day 1 Coat Beads with ab (o/n)Day 2 Add Samples Add Acceptor Beads Incubate Add Donor Beads Incubate Read,50,均相免疫分析,51,非均相免疫分析,52,本章内容,基
12、本概念和基础知识 标记免疫技术发展简史 标记免疫技术的基本理论 标记免疫技术的特点及局限性 标记免疫技术的应用,53,特点及局限性,特点 高特异性：标记免疫分析是利用抗原抗体反应测定样品中待测物质的浓度，因而具有较高的特异性。标记免疫分析方法的特异性取决于抗体的特异性。因此，抗体质量的优劣对测定结果有很大的影响。,54,特点及局限性,特点 高特异性,55,特点及局限性,特点 高敏感性 标记物质的高敏感性赋予标记免疫分析的高度敏感性，放光免疫分析已达皮克(pg)水平。,56,特点及局限性,特点 操作简便、快速； 自动化分析；,57,特点及局限性,局限性 不能检测分析物的生物活性 标记免疫分析所测
13、定的是被测物质的免疫学活性，而不是其生物学活性。虽然在一般情况下被测物质的免疫活性与生物活性是相关的，但在某些生理或病理的情况下二者并不一定相关，对此应有充分的理解。,58,特点及局限性,局限性 只能分析一定浓度范围的分析物 抗原抗体发应具有比例性，二者在一定浓度范围内才出现最强反应，检测信号与分析物存在一定计量关系。因此，标记免疫分析只适用于测定一定浓度范围的物质。,59,特点及局限性,局限性 难于标准化，一定程度上影响它的应用和实验室之间的质量控制； 抗原的纯化与标准化； 抗体的异质性与标准化； 反应体系中的基质效应,60,本章内容,基本概念和基础知识 标记免疫技术发展简史 标记免疫技术的基本理论 标记免疫技术的特点及局限性 标记免疫技术的应用,61,应用,实验室诊断的重要工具 感染性疾病 内分泌系统疾病 肿瘤 器官移植,62,免疫组化技术,特异性 敏感性 直观性,63,免疫组化技术,64,应用,检验医学发展需要临床医生参与,65,应用,基础医学研究的重要工具 蛋白质纯化 免疫-PCR 细胞分选,66,流式细胞术进行细胞分选和鉴定,
