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1、第十三章 基因工程基本原理简介 Chapter 13 The Basic Theory of Genetic Engineering,本章重点内容： 1. 什么是基因工程？ 2. 获得目的DNA片段的方法有哪些？ 3. DNA双脱氧测序技术的基本原理; 4. PCR技术的基本原理及其应用; 5. 核酸杂交技术的基本原理与应用； 6. 如何根据真核蛋白的氨基酸序列获得其cDNA？,第一节 基因工程原理简介一、基因工程的定义本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细
2、菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在细胞或宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。,目的基因获得,表达载体构建,基因的导入,鉴 定,核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot. 蛋白鉴定：SDS-PAGE; HPLC; Western blot. 功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。,原核:包涵体,分泌型 真核:穿梭质粒,文库 合成 PCR,基因组文库cDNA文库,细菌：氯化钙；电穿孔; 细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；
3、微注射；V 动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V,载体,质粒(plasmid)粘粒(cosmid) 噬菌体( phage),第二节 基因工程的基本步骤,第三节 基因工程中的方法学,一、核酸的提取纯化包括RNA、 DNA及plasmid DNA的提取纯化技术,二、核酸电泳技术1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE,+,三、DNA测序技术（Sequencing） 双脱氧终止法的原理,四、核酸探针（probe） 1. 原理； 2. 标记物； 3. 种类； 4. 应用,（一）Dot blot,（二）Southern blot： DNA,（三） Northern blotting: RNA
4、,五、Western blot: Protein,六、获得目的基因的方法基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合 成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技 术。（一）基因组文库目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。,家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与鉴定 Construction of Partial Genomic Library of Musica Domestica and Cloning and Identification of York Protein gene promoter,启动子克隆一般思路,实验一、家蝇部分基因组文
5、库的构建1. 材料与方法 1.1 家蝇基因组DNA的提取2.1 基因组DNA的部分酶切3.1 EMBL3载体臂的制备 4.1 连接与包装 5.1 基因组文库鉴定,Bcl I随机酶切,左臂 基因组DNA 右臂,基因组DNA,BamH I+CIP,Bcl I,Bcl I,BamH I,BamH I,包 装,转化,KW251,噬菌斑,1023kb,包装蛋白,技术路线图:,重组噬菌体,收集,噬菌体液,基因组文库,2. 结果,2.1 基因组DNA的提取,提取的基因组DNA 大于50kb,2.2 家蝇基因组DNA酶切和纯化,纯化了1023kb的Bcl I酶切DNA片段,实验二、家蝇卵黄蛋白基因组基因的 克
6、隆和序列分析,实验二、技术路线,实验二结果,GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAA CAAGAAGTCA CCGTTTTCATCACCGGTCTG CCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAA
7、AATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCC
8、CAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC,卵黄蛋白基因
9、部分DNA片段特异性探针序列,2.1 特异性探针制备,制备了大小为768bp的地高辛标记的DNA片段特异性探针，工作浓度为1：2000。,实验二结果,2.2 阳性克隆的筛选和纯化,1# positive clone （about 2000 plaques/plate）Fig.3 Screening result of 1st round situ hybridization 图3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果,YP1,2# positive clone （about 200 plaques/plate）Fig.4 Screening result of 2nd round situ hybri
10、dization 图4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果,Numbers：11 positive clone （11 plaques/plate）Fig.5 Screening result of 3rd round situ hybridization图5 第3次噬菌斑原位杂交筛选结果,获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆,2.0,2.3,4.4,6.6,9.4,23,1.4,1.6,2.0,3.5,4.3,5.0,21,1 2 3 4 5 6,kb,kb,Fig.6 Digestion analysis of recombinant -DNA of positive plaque 图6 阳性克隆
11、-DNA的酶切分析,实验二结果,2.3 mdYP基因组基因的克隆,1:Lambda DNA/Hind Marker 2: Xho, 3: Xho/Hind , 4: Hind , 5: Sal 6:DNA/EcoR+Hind Marker,1:Xho I，2:Hind 3:Xho/Hind Fig.7 Southern blot of recombinant -DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图7 阳性克隆-DNA的 Southern blot,实验二结果,2.3 mdYP基因组基因的克隆,1 ACAGAATTTG
12、CTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAA
13、ACAAAA 300301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATAT
14、ATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAAT
15、GGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 1000 1001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 1100 1101 CTTATTGAGGAAAAA
16、ATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT 1200 1201 TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA 1300 1301 ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTT
17、CAATTCT 1400 1401 CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT 1500 1501 TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG 1600 1601 GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAA
18、TTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG 1700 1701 TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA 1800 1801 GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC 1900 1901 AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC 2000 2001 AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100,
