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1、qPCR系统,“从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案,生物化学与分子生物学教研室,内容概要,荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程及注意事项荧光定量应用及实例,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,荧光定量PCR原理定义,荧光定量PCR原理常用名词概念,介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和
2、标准曲线对起始模板进行定量分析,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Logliner phase,平台期,荧光定量PCR原理扩增曲线,2. 荧光定量标准曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Logliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 真正的信号:荧光信号超过域值，进入指数扩增期之后 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段,Threshold,荧光定量PCR原理荧光域值,平台期,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物
3、的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct value,荧光定量PCR原理Ct值,同一个样品重复96次PCR的扩增曲线,荧光定量PCR原理PCR vs qPCR,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,非理想的PCR反应,XnX0 （1En）n,*,Xn：第n次循环后扩增产物数量,X0 ：起始模板数量,n：扩增循环数,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为Ct,XCtX0 （1En）CtM （1）,*,XCt ：在阈值设定以
4、后，XCt是一个常数，可以用荧光强度表示的产物量，定为M,方程式（1）两边同取对数得：,LogMLogX0 *（1En）Ct （2）,整理方程式（2）：,LogX0 Log M Ct Log（1En）,荧光定量PCR原理Ct值定量的数学原理,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Log of DNA concentration,起始模板量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,荧光定量PCR原理Ct值与模板起始量的关系,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,线性关系、扩增效率确认
5、,检测灵敏度确认,标准曲线斜率: -3 -3.5,35Cycles内可得到好的定量结果（科研领域） 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增,35 Cycles内无引物二聚体产生,相关系数（R2）：大于0.98,荧光定量PCR反应有效性的确认,PCR扩增效率（E）:0.9-1.2,定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO定量检测等相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯 片结果验证，差异显示结果验证等,荧光定量PCR技术的应用,内容概要,荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法荧
6、光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南,非特异性荧光标记SYBR Green I 特异性荧光标记TaqMan Probe 分子信标,常用荧光标记方法,SYBR Green I染料法原理,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR Green I 染料法作用机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA， SY
7、BR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green I 染料法作用机理,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,Single amplified product,溶解曲线检测引物特异性 Melt curve showing two am
8、plified products,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 应用范围,起始模板的测定融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Gree
9、n 法 优缺点,问题点：SYBR Green I与任何双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。,SYBR Green I染料法问题点与关键点,关键点：设计合适引物，防止非特异性扩增！,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter, R)3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,Taqman探针法工作机理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测
10、荧光,1、引物、探针的设计原则：探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段200 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的设定：一般为：94 ，10-20S60， 30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：100-900nM探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同,Taqman探针法PCR体系的建立,TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR的分类几种方法的比较,Molecular beacon 法(分子信标)原理,
11、标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光-变性过程：产生非特异性荧光-延伸过程：不产生荧光-退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon (分子信标) 应用范围,起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP（单核苷酸多态性）分析,Molecular beacon (分子信标) 优缺点,内容概要,荧光定量PCR原理荧光定量PCR的标记方法荧光定量PCR的解析方法SYBR法实验流程及注意事项TIANGEN公司荧光定量产品选择指南,
12、荧光定量PCR的解析方法（依据课题要求提前确定）,绝对定量解析方法,相对定量解析方法,绝对定量解析方法,绝对定量的定义,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品,可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,质粒标准品的制备,PCR,目的基因克隆,质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,目的基因,基因组DNA,拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）OD26050稀释倍数 样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍
13、比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,实时荧光定量PCR法绝对定量方法,方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取HBV DNA；设计特异引物；设计TaqMan探针
14、并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,实验数据,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,扩增效率（E）计算E = 10-1/斜率 1 = 10-1/-3.29 1= 2.011= 1.01,标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线,y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.9-1.2, 越接近1，越理想。,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性
15、方程：,20.5= -3.29 X + 40.33,QuantityUnknown=10 6.03=1,071,519 copies,绝对定量实验例乙肝病人血液中HBV的绝对定量,相对定量解析方法,理论上目的基因表达量分析条件,实际目的基因表达量分析,相对定量的必要性,必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、Actin、18S rRNA等,筛选方法,根据文献提供通过具体实验筛选,相对定量分析管家基因筛选,实时荧光定量PCR法TaqMan法举例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异,TaqMan法举例标记探针,使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量,Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针,TaqMan法举例材料准备,从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcriptase：基因组对照,
