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1、高效液相色谱法,基本要求：,1. 了解高效液相色谱法的优点及适用范围,2. 理解常用检测器的原理、优缺点及适用范围,3. 理解各种分离方式的原理及适用的分析对象及选择原则,4. 理解超临界流体色谱法的原理、优缺点及适用范围,(High Performance Liquid Chromatography，HPLC),高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。,高效液相色谱法与气相色谱法比较：气相色谱分离主要取决于组分分子与固定相之间的作用力。高效液相色谱分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果。高效液相色谱一般可在室温下进行。采用高入口压维持一定的流动相线速。,
2、高效液相色谱法与经典液相色谱法比较：高效液相色谱所用固定相颗粒细而规则，孔浅，能承受高压，加上使用高压输液设备和高灵敏度的检测器，其分离效率、分析速度和灵敏度都远远高于经典液相色谱法。,应用范围：在目前已知的有机化合物中，有80%的有机化合物能用高效液相色谱法分析。尤其适合那些不宜用气相色谱分析的难挥发性物质、热不稳定性物质、离子型物质和生物大分子等。由于此法不破坏样品，因此可方便地制备纯样。,1 固定相和流动相,1.1 固定相,按承受的高压能力,刚性固体,硬胶,二氧化硅为基质,聚苯乙烯与二乙烯基苯交联,承受较高的压力,承受低压力,按孔隙深度,全多孔微粒型,表面多孔型,表面多孔型是在实心玻璃外
3、面覆盖一层多孔活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂和聚酰胺等，其厚度为1-2m，以形成无数向外开放的浅孔。表面多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅、相对死体积小，出峰快，柱效高。但因多孔层厚度小，最大允许进样量受限制。,全多孔微粒型固定相颗粒细，孔仍然浅，因此传质速率仍很快，柱效高，但需更高的操作压力。全多孔微粒型由直径为10-3m数量级的硅胶微粒凝聚而成。最大允许进样量比表面多孔型大5倍。因此，通常采用此类固定相。,分 离 模 式,活性吸附剂固定相,化学键合相,离子交换剂,多孔材料固定相,1.2 流动相,在固定相选定之后，流动相的选择是最关键的。流动相的溶剂的要求是：,(1) 纯度高 可提高色谱
4、分离效果；防止溶剂中杂质污染柱子，固体颗粒会损害高压泵或输液通道，使压力升高，基线漂移。,(2) 粘度低 溶剂粘度较高，操作压力大，会使色谱柱性能降低，而且泵也容易损坏。,(3) 化学稳定性好,(4) 溶剂沸点要高于55 低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡。,(5) 溶剂要能完全浸润固定相并与流动相相匹配 溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相。,(6) 溶剂要与检测器匹配 例如采用示差折光率检测器，必须选择折光率与样品有较大差别的溶剂作流动相；若采用紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。,2 高效液相色谱仪,高效
5、液相色谱仪主要由高压输液系统（贮液器、脱气器、高压泵），进样系统（进样器和进样阀），分离系统预柱和分离柱）和检测系统等组成。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 工作过程如下图8.1所示,液相色谱仪,流 程,图片-1 高效液相色谱仪结构示意图,2.1 贮液器,贮液器用于存放溶剂。通常采用1-2L的大容量玻璃瓶，也可用不锈钢制成。贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为2m。,脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入检测器而使噪声剧增，甚至不能正常检测。通常用溶解度小的氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的
6、气体。先用氦气快速清扫溶剂数分钟，然后以极小流量不断流过此溶剂。,2.2 脱气装置,高压输液系统一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，高压输液泵是核心部件。要求密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。,2.3 高压泵,恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。,高压输液泵,恒压泵,恒流泵,机械注射泵,机械往复泵,2.4 梯度洗脱装置,梯度洗脱是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种方法。通过梯度装置将两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元或三元、四元梯度洗脱。梯度
7、改变可呈线性、指数型或阶梯型。,优点：改善峰形；提高柱效；减少分析时间；使强烈滞留的组分不容易残留在柱上。但在进行下次分析时，更换流动相达到平衡的时间长。,外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,1,2,3,4,5,图8.3 杀虫剂分析 1.灭多虫；2.Aldicarb 3.杀螨威4.西维因 5.methiocab,梯度洗脱曲线,0 3 6 9 12 15 18 20 21 min,图8-3表示用二元梯度来分离几种氨基甲酸酯类杀虫剂。采用4.
8、6mm内径，长度为15cm的C18柱（5m颗粒直径），溶剂组成在15min内，从10%（V/V）CH3CN-H2O随时间改变至50% CH3CN-H2O。由于CH3CN量的增多，流动相极性减小，杀虫剂与非极性的固定相C18柱的作用力减弱，而在流动相中的溶解度增大，因而使分析时间缩短。,2.5 进样系统,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。,进样阀,2.6
9、分离系统色谱柱,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱材料：有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。考虑耐压问题，金属管用得较多。柱长：530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。对于涂固定液的液液色谱法一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离的性能不受影响。,常用分离柱,柱体为直型不锈钢管，见下图,柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在
10、高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。,2.7 检测系统,在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:,（l）紫外检测器 （2）荧光检测器 (3) 示差折光率检测器几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 （4）电导检测器 (5)
11、 附属系统它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 .,紫外可见光、电化学检测器的流通池比较,1.紫外检测器,应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,1a.紫外光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较,普通
12、检测器,光电二极管阵列检测器,2. 荧光检测器 （fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应.,3. 示差折光检测器 （differential refractive index detector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,示差折光检测器光路,表8-1高效液相色谱检测器性能,3 液-固吸附色谱法(
13、LSAC),液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用力不同来进行分离的。,3.1分离原理,当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子，于是，在固定相表面发生竞争吸附:X + nSad Xad + nS,达平衡时，有,其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通
14、过吸附等温线数据求出。,3.2固定相,吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。,3.3 流动相,一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（0）来衡量。0越大，表示洗脱剂的极性越强。表8.2列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的0值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，数值可换算（0硅胶=0770氧化铝）。,
